DB37/ ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/SDVMA 003-2024 鉴别多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的 双重PCR方法 A dual PCR method for distinguishing Pasteurella multocida from Mannheimia haemolytica 2024-12 -12 发布 2024 - 12 - 12实施 山 东 省 兽 医 协 会 发布 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 003—2024 Ⅰ 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的 规则起草 。 本文件由山东省兽医协会提出并归口。 本文件起草单位： 山东省滨州畜牧兽医研究院、滨州市疾病预防控制中心、阳信县畜牧兽医管理服 务中心、滨州市检验检测中心、山东绿都生物科技有限公司、深圳市康百得生物科技有限公司。 本文件主要起草人： 王金良、张丽芳、丁卫平、徐晴晴、王凯、徐倩倩、邓凤林、莫玲、孟卫芹、 姚春阳、郭广君、唐娜、郭时金、陈金龙、胡绍良。 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 003—2024 1 鉴别多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的多重 PCR方法 1 范围 本文件规定了多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌 PCR鉴别检测方法。 本文件适用于多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 563 禽霍乱（禽巴氏杆菌病）诊断技术 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂或材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯。 4.1 水，GB/T 6682 ，一级。 4.2 磷酸盐缓冲溶液（ PBS）：取Na2HPO4•12 H 2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 8 g，溶 于800 mL水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH调节至7.4 ，加水定容至 1 000 mL，121 ℃高压灭 菌15 min，4 ℃保存备用。 4.3 引物：引物名称和序列见附录 A。 4.4 商品化的 PCR反应试剂。 4.5 商品化的凝胶电泳试剂。 4.6 阳性对照：分别含有多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌扩增目的基因的阳性质粒。 4.7 阴性对照：灭菌水。 5 仪器设备 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 003—2024 2 5.1 PCR扩增仪。 5.2 高速冷冻离心机：可控温至 4 ℃，转速≥ 12 000 r/min。 5.3 高压蒸汽灭菌器。 5.4 二级生物安全柜。 6 试验步骤 6.1 样品处理 对分离鉴定和纯化培养的细菌液体培养样品，直接保存于 1.5 mL无菌离心管中，密封，编号，保 存，送检。 6.2 核酸提取 取1 mL菌液加入 1.5 mL离心管， 12 000 r/min 离心1 min，弃上清，加入 100 μL无菌水中，混 匀，沸水浴 10 min，冰浴5 min，12 000 r/min离心1 min，上清液作为基因扩增的模板。 6.3 PCR 检测 6.3.1 反应体系的配制： 反应体系的配制按照附录 B表B.1。 6.3.2 加样：在各设定的 PCR管中分别加入阳性对照、阴性对照和提取的试样溶液 2 μL，盖紧管盖，混 匀，瞬时离心。 6.3.3 反应条件： 95 ℃预变性 5 min，95℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 个循环， 72 ℃ 延伸6 min，结束反应。 7 结果判定 7.1 试验成立条件 当阳性对照扩增出约 460 bp、206 bp的片段， 阴性对照未扩增出片段时， 试验成立， 见附录 C图C.1。 7.2 阳性结果判定 被检样品扩增出约 460 bp的片段，则判定被检测样品中含有多杀性巴氏杆菌核酸；被检样品扩增出 约206 bp的片段，则判定被检测样品中含有溶血性曼氏杆菌核酸；被检样品扩增出约 460 bp和206 bp 的片段，则判定被检测样品中含有多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌的核酸。 7.3 阴性结果判定 被检样品未扩增出约 460 bp的片段，则判定被检测样品中不含有多杀性巴氏杆菌核酸；被检样品未 扩增出约 206 bp的片段，则 判定被检测样品中不含溶血性曼氏杆菌核酸。 全国团体标准信息平台