(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111470258.4 (22)申请日 2021.12.0 3 (71)申请人 四川大学 地址 610065 四川省成 都市一环路南 一段 24号 (72)发明人 程磊　陈曦　任彪　周学东　 (74)专利代理 机构 成都天汇致远知识产权代理 事务所(普通 合伙) 51264 代理人 韩晓银 (51)Int.Cl. A61K 31/5375(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 1/02(2006.01) A61P 1/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01)C12Q 1/18(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 叔胺单体在制备抑制口腔及胃部幽门螺杆 菌药物中的用途 (57)摘要 本发明属于抗幽门螺杆菌治疗技术领域， 公 开了一种叔胺单体在制备抑制口腔及胃部幽门 螺杆菌药物中的用途。 通过平板及菌悬液培养， 确定药物 最小抑菌浓度及最小杀菌浓度； 药物作 用下细菌菌量变化测定和药物对细菌毒力水平 影响测定： 细胞安全性检测。 针对现有条件下缺 乏有效治疗幽门螺杆菌感染的局部药物， 及幽门 螺杆菌抗生素耐药率逐年上升的情况， 本发明首 次结合DMA EM的pH敏感特性， 将DMA EM作用于幽门 螺杆菌， 发现其对幽门螺杆菌具有显著的杀菌作 用， 可有效防治幽门螺杆菌感染。 同时检测DMA EM 具有良好生物 安全性。 本发明具有较强抗幽门螺 杆菌生长及增殖效果， 从而减少抗生素的不良使 用， 进而减少抗生素耐药及其导致的宿主菌群紊 乱的问题。 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 CN 113975281 A 2022.01.28 CN 113975281 A 1.一种具备有pH敏感抗菌特性的新型叔胺单体(DMAEM， dodecylmethylaminoethyl   methacrylate)在制备抑制口腔及胃部幽门螺杆菌药物中的用途。 2.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， 所述新型叔胺单体作用于幽门螺杆菌后， MIC 为8 μg/mL； 对于幽门螺杆菌的MBC为64 μg/mL； 叔胺作用浓度在＞8 μg/mL时能对幽 门螺杆菌 的生长繁殖及致病作用起到有效抑制， 而在＞64 μg/mL时能有效杀灭幽门螺杆菌 。 3.一种如权利要求1～2任意一项所述用途中的新型叔胺单体作为抗幽门螺杆菌的新 型材料的药效检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法包括： 步骤一， 平板及液体培 养基培养， 确定药物最小抑菌浓度及最小杀菌浓度； 步骤二， 药物作用下细菌 菌量变化测定和药物对细菌毒力水平影响测定： 步骤三， 细胞安全性检测。 4.如权利要求3所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤一中， 平板及液体培养基培养 具体过程 为： 使用10 μL一次性接种环， 将幽门螺杆菌均匀涂抹于CBA固体培养基上， 置于二氧化碳恒 温孵箱， 37℃， 微需氧 条件下培 养24小时； 所述微需氧条件为： 5％氧气， 10％二氧化 碳和85％氮气。 药物最小抑菌浓度及最小杀菌浓度确定， 具体过程 为： 使用10 μL一次性接种 环， 从CBA培养基上刮下新鲜菌体， 置于BHI血清培养基中， 交替使 用枪尖吹打和涡旋振荡器充分 混匀； 使用多功 能酶联检测仪SpectraMax  iD5调节菌液OD值为OD600nm＝0.3， 稀释10倍， 此 时菌液浓度约为1 ×105CFU/mL； 菌液加入无菌96孔板， 体系为100 μL， 加入98 μL菌悬液与2 μL   2倍连续稀释后的DMA EM， 使药物浓度为0、 0.5、 1、 2、 4、 8、 16、 32、 64、 128 μg/mL， 置于孵箱中培 养24小时； 后观 察菌液清亮的最低药物浓度组为该药物MIC， 从每个药物作用浓度的孔中吸 取2 μL菌液垂直悬空滴加 于CBA培养基， 培养24小 时后， 无菌落生成的最低药物浓度为该药 物的MBC， 该实验设置三组平行样本 。 5.如权利要求3所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤二中， 药物作用下细菌菌量变 化测定过程 为： 制备活菌 菌量标准曲线和菌量测定； 制备活菌 菌量标准曲线具体过程 为： 使用无菌10 μL一次性接种环刮下CBA固体培养基上菌体置于PBS， 混匀， 调节OD600nm＝ 1， 菌液浓度约为1 ×108CFU/mL； 依次10倍梯度稀释， 得到1 ×108CFU/mL、 1 ×107CFU/mL、 1 × 106CFU/mL、 1 ×105CFU/mL和1 ×104CFU/mL浓度菌液各1mL； 该实验设置三组平行样本， 按照 细菌基因组DNA提取试剂盒说明书操作； 将上述中所得样本通过5000g离心10分钟， 以提取 的DNA为模板， 使用TB  GreenTMPremix Ex TaqTMII试剂盒， 采用12.5 μL体系， 在LightCycler   480II System实时荧光定量PCR仪上运行， 检测幽门螺杆菌16S  rDNA基因； 以细菌浓度的对 数值作为横坐标x值， 上一步得到的CT值为纵坐标y值绘制回归曲线， 得到标准方程y＝kx+ b， 所得实验数据的统计学分析使用软件S PSS 16.0完成； 菌量测定过程为： 使用多功能酶联检测仪SpectraMax  iD5检测细菌OD值； 取各药物浓 度菌液1mL， 提取细菌DNA， 通过qPCR 获得CT值， 并通过 上述得到公式进行活菌 菌量测定； 药物对细菌毒力测定具体过程 为： 在测得DMAEM对幽门螺杆菌的MIC为8 μg/mL， 在MIC以下， 取药物浓度为0、 0.5、 1、 2、 4、 8 μ权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113975281 A 2g/mL作用于幽门螺杆菌并孵 育24小时； 富 集菌液1mL， 5 000rpm离心10分钟， Trizo l重悬； 提取细菌RNA： 转移至加有氧化锆磁珠的破壁管中， 液氮冷却， 在高速组织匀浆机中破 碎细胞； 冰浴2 ‑5分钟， 待破壁过程产生的气泡逐渐消失； 加 入350 μL“氯仿： 异戊醇(24:1) ” 溶液， 涡旋振荡器震荡15秒， 静置10分钟； 13000rpm， 4℃， 离心15分钟； 吸取400 μL上层澄清 液体， 转移至新的无酶EP管内； 依次加入已预冷的350 μL高盐溶液和250 μL异丙醇， 上下颠倒 EP管数次以充分混匀， 静置10分钟； 13000rpm， 4℃， 离心15分钟； 弃去上清液， 13000rpm， 4 ℃， 离心2分钟， 小心去尽上清液； 向沉淀中加入1mL提前预冷的70％乙醇溶液， 上下颠倒EP 管数次， 13000rpm， 4℃条件下离心5分钟； 弃去上清， 自然风干底部沉淀； 根据底部沉淀多 少， 加入40 ‑70 μL无酶水； 65℃水浴10分钟， 使用无酶枪尖吹打混匀； 使用NanoDrop  2000分 光光度计测定RNA的浓度和纯度； RNA纯化及反转录： 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂 盒， 去 除RNA样本中的DNA进行 纯化及后续的RNA反转录过程。 6.如权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量反转录聚合酶链式反 应： 以反转录后的cDNA为模板， 每个样本设置4个复孔， 使用TB  GreenTMPremix Ex TaqTMII 试剂盒， 采用20 μL体系； 在LightCycler  480II System实时荧光定量PCR仪上运行， 确定反 应条件； 以幽门螺杆菌管家基因16SrRNA为内参基因， 使用2 ‑ΔΔCT法进行幽门螺杆菌16S   rRNA、 VacA、 Ca gA、 UreaB、 FlaA、 LuxS的表达检测。 7.如权利要求3所述的检测方法， 其特 征在于， 所述 步骤三中， 细胞安全性检测过程 为： 96孔板里， 接种1x104个HOK细胞或L929细胞， 于5％CO2细胞培养箱、 37℃过夜孵育； 细胞 贴壁后， 吸去原培养基， 加入新鲜100 μL含不同浓度DMAEM的DMEM培养基， 在37℃细胞培养箱 孵育； 每组6个复孔， 24h后， 利用C CK8试剂盒进行细胞增殖毒性检测。 8.如权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述细胞安全性检测过程还包括： 吸去 原培养基， PBS洗三遍， 加入100 μL含10％CCK8试剂的DMEM培养基， 37℃细胞培养箱内避光孵 育； 1～2小时后， 吸取 上清转移到新的96孔板， 在酶标仪下读取A45 0的光吸收值。 9.一种抑制口腔及胃部幽门螺杆菌的检测试剂盒， 其特征在于， 所述抑制口腔及胃部 幽门螺杆菌的检测试剂盒包 含权利要求1～ 2任意一项所述 新型叔胺单体。 10.一种如权利要求1～2任意一项所述新型叔胺单体在制备抗幽门螺杆菌及 幽门螺杆 菌导致的慢性胃炎、 胃溃疡、 胃腺癌、 黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的相关疾病药物中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113975281 A 3