(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111501944.3 (22)申请日 2021.12.09 (71)申请人 深圳先进技 术研究院 地址 518055 广东省深圳市西丽大 学城学 苑大道1068号 申请人 中国科学院深圳理工大 学 （筹） (72)发明人 万晓春　曹国政　 (74)专利代理 机构 北京中巡通大知识产权代理 有限公司 1 1703 代理人 李宏德 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/867(2006.01)A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (54)发明名称 分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体T细胞及 其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种分泌双特异性抗体的嵌 合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。 实验发 现靶向GPC3同时分泌双特异性抗体的嵌合抗原 受体T细胞， 对GPC3和CD276阳性肿瘤细胞系有较 强的杀伤活性， 并且对GPC3阴性CD276阳性肿瘤 细胞系有较强的杀伤活性， 因此所述分泌双特异 性抗体的嵌合抗原受体T细胞在肝细胞癌等的治 疗中有较大的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表18页 附图2页 CN 114163537 A 2022.03.11 CN 114163537 A 1.一种靶向GPC3同时包含双特异性抗体的嵌合抗原受体， 其特征在于： 该嵌合抗原受 体包括靶向GPC3的单链抗体、 胞外铰链区、 跨膜区、 共刺激信号区、 CD3ζ胞内区、 剪切肽、 IGHV3‑2信号肽、 靶向CD276的单链抗体、 连接 子以及靶向CD3的单链抗体。 2.根据权利要求1所述一种靶向GPC3同时包含双特异性抗体的嵌合抗原受体， 其特征 在于： 所述胞外铰链区选自CD 8α 铰链区、 CD28铰链区、 IgG1铰链区或IgG4铰链区。 3.根据权利要求1所述一种靶向GPC3同时包含双特异性抗体的嵌合抗原受体， 其特征 在于： 所述 跨膜区选自CD 8α 跨膜区、 CD4 跨膜区、 CD28跨膜区、 CD3ζ 跨膜区或ICOS跨膜区。 4.根据权利要求1所述一种靶向GPC3同时包含双特异性抗体的嵌合抗原受体， 其特征 在于： 所述共刺激信号区选自4 ‑1BB胞内区、 CD28胞内区、 OX40胞内区、 ICOS胞内区或CD27胞 内区。 5.一种靶向GPC3分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体T细胞， 其特征在于： 该T细胞包括 如权利要求1所述的靶向GPC 3同时包含双特异性 抗体的嵌合 抗原受体。 6.一种重组病毒载体， 其特征在于： 该重组病毒载体包括如权利要求1所述的靶向GPC3 同时包含双特异性 抗体的嵌合 抗原受体的对应编码基因。 7.根据权利要求6所述一种重组病毒载体， 其特征在于： 所述重组病毒载体中， 靶向 GPC3同时包含双特异性 抗体的嵌合 抗原受体的基因序列如SEQ.ID.NO.25所示。 8.一种靶向GPC3分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体T细胞的制备方法， 其特征在于： 包 括以下步骤： 1)将如权利要求1所述的靶向GPC3同时包含双特异性抗体的嵌合抗原受体的对应编码 基因插入到pWPXLd载体中， 得到 重组质粒； 2)将所述重组质粒与包膜质粒、 包 装质粒共转染， 得到 重组慢病毒； 3)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞， 经分离获得靶向GPC3分泌双特异性抗体 的嵌合抗原受体T细胞。 9.一种治疗肝细胞癌的药物， 其特征在于： 该药物包括如权利要求5所述的靶向GPC3分 泌双特异性 抗体的嵌合 抗原受体T细胞。 10.一种如权利要求5所述的靶向GPC3分泌双特异性抗体的嵌合抗原 受体T细胞在制备 抗肿瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114163537 A 2分泌双特异性抗体的嵌合 抗原受体T细胞及其制备方 法和 应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物制品， 具体涉及靶向GPC3同时分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体 T细胞及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]肝细胞癌是常见的恶性肿瘤， 占所有原发性肝癌的90％， 是全球第二大致死性癌 症。 大多数肝细胞癌病人接受局部或系统性疗法， 比如化疗、 放疗、 皮肤乙醇注 射、 射频消融 术、 各种栓塞疗法、 抗体疗法如免疫检查点抑制剂、 血管内皮生长因子受体抑制剂和靶向疗 法如索拉菲尼， 然而这些疗法的疗效都是不够的(Lee,Y.H.,et  al.,Combinational   Immunotherapy  for Hepatocellular  Carcinoma:Radiotherapy,Immune  Checkpoint   Blockade and Beyond.Frontiers  in Immunolo gy,2020.11.)， 对病人和病人的家庭造成 了难以挽回的伤害。 因此迫切需要的新的治疗肝细胞癌的药物。 [0003]CAR‑T(嵌合抗原受体T细胞)技术是近年来发展的细胞免疫疗法， 它通过基因工程 手段(例如基于重组病毒载体的转导)使嵌合抗原受体表达在T细胞表面， 通过在体外制备 和扩增嵌合抗原受体T细胞， 然后回输至人体， 激活自身免疫系统， 发挥对肿瘤细胞的高效 杀伤(Rafiq,S.,C.S.Hackett,and  R.J.Brentjens,Engineering  strategies  to  overcome the current roadblocks  in CAR T cell therapy.Nature  Reviews Clinical   Oncology,2020.17(3):p.147 ‑167.Benmebarek,M.R.,et  al.,Killing  Mechanisms  of  Chimeric  Antigen Receptor(CAR)T  Cells.International  Journal of Molecular   Sciences,2019.20(6).)。 嵌合抗原受体T细胞技术被认为是最有可能攻克癌症的疗法， 并 且靶向CD19的CAR ‑T细胞在血液肿瘤中产生了良好的效果。 目前全球已有6款CAR ‑T药物获 批上市， 展现了 CAR‑T细胞在治疗恶性肿瘤中的巨大应用前 景。 [0004]然而CAR‑T细胞治疗面临肿瘤抗原异质性表达、 抗原丢 失的难题。 首先在急性淋巴 细胞白血病中， CD19阴性细胞群可以逃避靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的识别， 导致细胞 群的过度生长， 产生疾病的复发。 另外在胰腺癌、 前列腺癌和神经母细胞瘤的临床前研究 中， 单抗原靶向的嵌合抗原受体T细胞并不能根除肿瘤， 这是因为嵌合抗原受体T细胞不能 识别这些肿瘤细胞表达的低密度的靶抗原(Anurathapan,U.； Chan,R.C.； Hindi,H.F.； Mucharla,R.； Bajgain,P.； Hayes,B.C.； Fisher,W.E.； Heslop,H.E.； Rooney,C.M.； Brenner,M.K.； et  al.Kinetics  of tumor destruction  by chimeric  antigen  receptor ‑modified  t cells.Mol.Ther.2014,22,623 –633.O’Rourke,D.M.； Nasr allah, M.P.； Desai,A.； Melenhor st,J.J.； Mansfield,K.； Morrissette,J.J.D.； Martinez ‑Lage, M.； Brem,S.； Maloney,E.； Shen,A.； et  al.Asingle  dose of peripherally  infused  egfrviii ‑directed  car t cells mediates  antigen loss and induces adaptive   resistance  in patients  with recurrent  glioblastoma.Sci.Transl.Med.2017,9, eaaa0984)。 在肝细胞癌中， 血清中GPC3含量升高， 抑制了靶向GPC3的嵌合抗原受体T细胞与说　明　书 1/7 页 3 CN 114163537 A 3