(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111529548.1 (22)申请日 2021.12.14 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.21383 2020.12.16 (71)申请人 浙江农林大 学 地址 310000 浙江省杭州市临安区锦城街 道武肃街6 66号 (72)发明人 宋厚辉　程昌勇　孙静　汪枫婷　 夏菁　陈绵绵　徐加利　卫芳芳　 陈中炜　 (74)专利代理 机构 北京中政联科专利代理事务 所(普通合伙) 11489 代理人 邵娟 (51)Int.Cl. C12N 15/74(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/66(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌 疫苗及制备方法 (57)摘要 本发明提供一种以重组减毒单増李斯特菌 为载体的结肠癌疫苗及制备方法， 涉及基因工程 领域， 是以减毒单増李斯特菌背景菌株Lemo ‑C07 为背景载体， 利用PCR技术扩增Lemo ‑C07的hly基 因498bp以及hly基因下游500bp分别作为片段A 和片段B； 利用SOE ‑PCR技术将三个片段(抗原片 段AH1设计在引物上)连在一起获得A ‑B的目的片 段， 如序列 SEQ ID NO.1所示； 以Kpn Ⅰ和PstⅠ为酶 切位点， 经酶切、 酶连至李斯特菌穿梭质粒 pKSV7， 获得重组质粒pSL1885， 并经质粒电转、 同 源重组和质粒丢失， 获得重组减毒单増李斯特菌 载体疫苗。 将肿瘤特异性抗原 基因整合至减毒李 斯特菌基因组中， 使抗原基因能够稳定表达， 不 易丢失； 使用的减毒株Lemo ‑C07与野生株相比， 毒力降低了近10000倍； 不含抗性质粒， 无抗生素 耐药风险， 安全性更高。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114250244 A 2022.03.29 CN 114250244 A 1.一种重组质粒， 其特征在于， 所述重组质粒包括基因序列 为如SEQ ID NO:1的基因片 段。 2.一种重组减毒单増李斯特菌， 其特征在于， 所述重组减毒单増李斯特菌含有权利要 求1所述的重组质粒。 3.一种以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗株， 其特征在于， 所述苗株命名 为LADS‑AlfaH1， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物， 保藏编号为CGMCC   No.21383。 4.一种以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗， 其特征在于， 含有权利要求3所 示的以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗株。 5.一种以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗的制备方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 构建同源重组质粒pSL1885， 所述重组质粒包括基因序列为如SEQ  ID NO:1的基因片 段； 制备减毒单增李斯特菌感受态细胞； 将所述重组质粒pSL1885电转入所述减毒单增李斯特菌感受态细胞中， 并培养得到单 克隆抗体； 同源重组及筛 选获得表达L LO‑AH1融合蛋白的重组减毒单増李斯特菌载体疫苗。 6.根据权利要求5所述的以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗的制备方法， 其特征在于， 所述构建同源重组质粒pSL18 85的步骤为： 以Lemo‑C07全基因组DNA为模板和含有AH1基因序列的引物， 利用PCR技术扩增分别含 酶切位点Kpn Ⅰ和PstⅠ的498bp片段A和500bp片段B； 通过SOE ‑PCR技术将两个片段连在一起 获得AB的目的片段， 并以Kpn Ⅰ和PstⅠ为酶切位点， 经酶切、 酶连克隆至穿梭质粒pKSV7， 获得 同源重组质粒pSL18 85。 7.根据权利要求5所述的以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗的制备方法， 其特征在于， 得到单 克隆抗体的 的步骤为： 将重组质粒pSL1885通过电转仪电转入上述制备的感受态细胞中， 电击后， 迅速加入预 热的BHI液体培养基， 充分混匀后移至EP管中， 恒温培养并离心， 重悬后的菌体涂布于含氯 霉素抗性的BHI固体培 养基中， 置 于恒温培 养箱培养得到单 克隆抗体。 8.根据权利要求5所述的以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗的制备方法， 其特征在于， 所述同源重组及筛选获得表达LLO ‑AH1融合蛋白的重组减毒单増李斯特菌载 体疫苗的步骤为： 取上述获得的单 克隆落接种于BHI液体培 养基中， 置 于37℃震荡 过夜培养； 用引物进行菌液PCR验证； 将对应克隆抗体接种于BHI液体培养基中置于42℃条件下传 代培养进行同源重组， 传代培 养至适当代数将菌液划线， 获得 单克隆抗体； 进行PCR产物测序， 测序 结果比对成功则认为同源重组整合成功； 将筛选出的单克隆接 种于不含抗性的BHI液体培养基中， 于30℃条件下传代以丢掉同源重组后的质粒， 划线挑取 单克隆进行抗性筛选获得无抗性的克隆， 经基因测序验证正确后获得表达LLO ‑AH1融合蛋 白的重组减毒单増李斯特菌载体疫苗。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114250244 A 2以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗及制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及基 因工程技术领域， 具体涉及以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠 癌疫苗及制备 方法。 背景技术 [0002]结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤， 好发于直肠与乙状结肠交界 处。 结肠癌主要为腺癌、 黏液腺癌、 未分化癌。 大体形态呈息肉状、 溃疡型等。 结肠癌可沿肠 壁环行发展， 沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润， 除经淋巴管、 血流转移和局部侵犯 外， 还可向腹腔内种植或沿缝线、 切口面扩散转移。 结肠癌发病的主要与高脂肪和低纤维素 饮食有关。 结肠的慢性炎症使肠癌的发生 率比一般人群高。 [0003]治疗癌症的传统方法是手术切除、 放疗、 化疗和治疗性疫苗。 手术切除、 放疗、 化疗 易出现肿瘤转移和复发等弊端， 相比之下免疫疗法的优点是对机体的伤害小、 毒性低， 但目 前肿瘤相关的疫苗主要是传统的灭活疫苗及亚单位疫苗， 存在 免疫周期长， 免疫效果差等 缺点。 [0004]基于细菌 的疫苗作为抗原传递载体具有生产成本低， 遗传稳定性， 安全性和高效 的抗肿瘤作用等优势。 如何提供一种肿瘤 免疫治疗疫苗， 能有效解决传统疫苗等治疗方法 的局限性， 能更好的提高免疫治疗效果， 缩短免疫周期， 提高癌症患者的存活率， 是当前亟 需要解决的问题。 发明内容 [0005]解决的技 术问题 [0006]针对现有技术的不足， 本发明提供了一种以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠 癌疫苗及制备 方法， 解决背景技 术所提出的至少一个问题。 [0007]技术方案 [0008]为实现以上目的， 本发明通过以下技 术方案予以实现： [0009]第一方面： 本发明提供一种重组质粒， 所述重组质粒包括基因序列为如SEQ  ID NO:1的基因片段。 [0010]第二方面： 本发明提供一种重组减毒单増李斯特菌， 所述重组减毒单増李斯特菌 含有权利要求1所述的重组质粒。 [0011]第三方面： 本发明提供一种以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗株， 所 述苗株命名为LADS ‑AlfaH1， 保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物， 保藏编号 为CGMCC No.21383。 [0012]第四方面： 本发明提供一种以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗， 含有 权利要求3所示的以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗株。 [0013]第五方面： 本发明提供一种以重组减毒单増李斯特菌为载体的结肠癌疫苗的制备 方法， 包括以下步骤：说　明　书 1/7 页 3 CN 114250244 A 3