(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111525584.0 (22)申请日 2021.12.14 (71)申请人 中国医学 科学院医药生物技 术研究 所 地址 100050 北京市东城区天坛西里1号 (72)发明人 解云英　常珊珊　罗梦娜　何宁　 李怡宏　王梦源　 (74)专利代理 机构 北京市诚辉律师事务所 11430 专利代理师 范盈　李玉娜 (51)Int.Cl. C07K 11/02(2006.01) C12P 21/04(2006.01) A61K 38/15(2006.01) A61P 35/00(2006.01)C12N 9/10(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一组非核糖体多肽(NRPs)类化合物、 其制备 方法及应用 (57)摘要 本发明涉及一组非核糖体多肽(NRPs)类化 合物、 其制备方法及应用， 所述的化合物的化学 结构如下式1、 式2、 式3所示， xylaroamide  A1 的[M+Na]+m/z 831， xylaroamide  A2的[M+Na]+ m/z 817， xylaroamide  A3的[M+Na]+m/z 845。 本 发明还涉及通过发酵生成所述的非核糖体多肽 (NRPs)类化合物的方法以及所述非核糖体多肽 (NRPs)类化 合物在制备 药物中的应用。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图8页 CN 114805496 A 2022.07.29 CN 114805496 A 1.一组来自于真菌菌株Xylaria  sp.218_066的非核糖体多肽(NRPs)类化合物， 其特征 在于， 所述的化 合物的化学 结构如下式1、 式2、 式3所示， xylaroamide A1的[M+Na]+m/z 831， xylaroamide  A2的[M+N a]+m/z 817， xylaro amide  A3的[M+Na]+m/z 845。 2.包含权利 要求1所述非核糖体多肽(NRPs)类化合物的药物或药物制剂， 其特征在于， 所述的药物或药物制剂包含， 治疗有效量的所述非核糖体多肽(NRPs)类化合物， 以及必要 的药用辅料。 3.权利要求1所述的非核糖体多肽(NRPs)类化合物在制备药物中的应用， 其特征在于， 所述的药物为细胞毒类抗肿瘤药物， 优选的， 所述的肿瘤为结直肠癌、 肺癌、 乳腺癌。 4.发酵生产权利要求1所述非核糖体多肽(NRPs)类化合物的方法， 其特征在于， 所述的 方法包括如下 特征： (1)使用Xylaria  sp.218‑066菌株， 采用二级液体发酵方法， 发酵培养基为F1培养基， 发酵条件为28℃， 液体静置发酵， 液体发酵的时间为8 ‑12天； (2)发酵产物粗纯： 将液体发酵产物冷冻干燥后， 使用甲醇提取粗 提物； 步 (3)发酵产物精纯： 使用乙酸乙酯提取粗提物， 吹干溶剂后， 用甲醇溶解粗提物。 甲醇溶 解物通过离心后， 取上清液上样至ODS固相萃取柱， 然后用甲醇进行洗脱， 分离目标产物即 得。 5.参与权利要求1所述非核糖体多肽(NRPs)类化合物微生物合成的关键基因， 所述的 基因为反式作用的N ‑甲基转移酶， 参与二巯基苯那林的生物合 成， 其特征在于， 其核苷 酸序 列如SEQ ID NO.2所示， 编码蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO.1所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114805496 A 2一组非核糖体多肽(NR Ps)类化合物、 其制备方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体的， 涉及一组非核糖体多肽(NRPs)类化合物、 其制 备方法及应用。 背景技术 [0002]非核糖体多肽(NRPs)是一类重要的微生物来源的活性天然产物， 临床上常用的抗 生素,如青霉素、 达托霉素和万古霉素[1]均为这类化合物。 复杂的结构赋予这类化合物具有 多种生物活性， 如抗菌活性， 抗癌， 抗炎等作用[2]。 近年来， 对于这类化合物的挖掘， 呈现两 种策略： 一是通过对来自不同环境的样本进行生物活性筛选， 二是借助生物信息学工具挖 掘基因组序列中的相关的生物合成基因簇[2]。 [0003]基于第二种策略， 存在一个难以忽视 的挑战： 微生物基因组中许多基因在实验室 传统的培养条件下是保持沉默的[3]。 常见的激活沉默的生物合成基因簇的策略有基因敲 除[4]、 启动子交换[5]、 转录因子过度表达[6]以及OSMAC(One  Strain Many Compounds)策略 研究[7‑9]。 其中OSMAC策略研究是一种比较 容易操作， 激活沉默生物合成基因簇的一种手段， 通过系统地改变菌株发酵过程中的某个培养参数(如培养基组成[7]、 液体或固体条件[8]、 静 态或搅拌发酵[9])， 极大地增加单个菌株产生的新的和潜在生物活性次级代谢产物的数 量[10]。 但如何从复杂的微生物次级代谢产物快速筛选出目标化合物仍然是发现新型NRPs 类化合物的一个问题。 [0004]分子网络(molecular  networking,MN)技术是一种基于LC ‑MS/MS图谱信息对结构 相关性分子进 行分组的计算算法， 它可以自动 将具有相似碎片模式或相同断裂规律的化合 物聚集成簇， 从而生成可视化分子网络图[11]。 同时， 在多种天然产物图谱数据库(如全球天 然产物社会分子网络(GNPS)数据库[11]和massbank)的注释下， 在天然产物的初期分离过程 中实现地对已知化合物的排重， 有效降低已知化合物的重复发现概率[12]。 在质谱中， NRPs 通常会产生特征性片段， 因为它们所含的酰胺和/或酯 键在质谱仪碰撞过程中容易断裂。 因 此， 基于MS/MS的分子网络是发现新型NRPs的一种高效策略。 结合OSMAC策略研究， 我们建立 了一种基于MS /MS的分子网络方法， 旨在从复杂样品中发现新型N RPs， 为进一步的药物研究 提供储备 药物。 [0005]参考文献 [0006][1]Yu D,Xu F,Zhang  S,et al.Decoding  and reprogramming  fungal  iterative  nonribosomal  peptide synthetases[J].Nat  Commun,2017,8 :15349. [0007][2]Vassaux  A,Meunier  L,Vandenbol  M,et al.Nonribosomal  peptides  in  fungal cell factories:from  genome mining to optimized heterologous  production [J].Biotechnol Adv,2019,37(8):1074 49. [0008][3]Ochi K,Hosaka  T.New strategies  for drug discovery:activation  of  silent or weakly expressed  microbial  gene clusters[J].Appl  Microbiol   Biotechnol,2013,97(1): 87‑98.说　明　书 1/9 页 3 CN 114805496 A 3