(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111454984.7 (22)申请日 2021.12.02 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113846058 A (43)申请公布日 2021.12.28 (73)专利权人 诺希 （天津） 生物科技有限公司 地址 300400 天津市滨 海新区经济技 术开 发区洞庭路220号天津国际生物医药 联合研究院实验楼N212室第9单 元 专利权人 天津市第四中心医院 (72)发明人 张杨　周春晶　 (74)专利代理 机构 北京瑞盛铭杰知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11617 代理人 栗华楠 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) A61K 35/28(2015.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 25/00(2006.01) (56)对比文件 CN 109266603 A,2019.01.25 CN 112048471 A,2020.12.08 CN 113181215 A,2021.07.3 0 CN 109369797 A,2019.02.2 2 US 2016361399 A1,2016.12.15 Yuji S. Takeda 等.Neuro nal Differentiati on of Human Mesenc hymal Stem Cells Using Exosomes Derived from Differentiati ng Neuro nal Cells. 《PLoS ONE》 .2015,第10卷(第8 期), 王含必 等.外泌体的生物功能及临床治 疗 应用潜能. 《生殖医学杂志》 .2021,第3 0卷(第7 期), 审查员 张进 (54)发明名称 一种骨髓间充质干细胞外泌体及其制备与 应用 (57)摘要 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一 种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体及其在制备 缓解癌性疼痛和抑制癌细胞增殖药物方面的应 用。 所述外泌体是以培养过肿瘤细胞的培养液培 养骨髓间充质干细胞后收集培养液， 并从培养液 中收集获得。 相比于现有技术， 即骨髓间充质干 细胞直接分泌的普通外泌体， 本发 明肿瘤细胞培 养液刺激骨髓间充质干细胞后分泌的诱导外泌 体， 诱导外泌体表达抗伤害感受因子更强， 使得 相应蛋白表达增加， 进而更加有效缓解由肿瘤引 起的癌性疼痛， 同时能够增强对癌细胞增殖的抑 制作用。 权利要求书1页 说明书7页 附图7页 CN 113846058 B 2022.02.18 CN 113846058 B 1.一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体， 其特征在于， 所述外泌体是由肿瘤细胞培养 液于37℃、 5% CO2条件下刺激骨髓间充质干细胞产生； 所述肿瘤 细胞为黑素瘤细胞、 纤维肉瘤 细胞或肺癌细胞； 所述肿瘤细胞培养液为： 肿瘤细胞贴壁培养至密度为80 ‑90%时， 去除肿瘤细胞后收集 的培养液。 2.权利要求1所述外泌体的制备方法， 其特征在于， 以培养过肿瘤细胞的培养液培养骨 髓间充质干细胞后收集培 养液， 从培 养液中收集外泌体。 3.如权利要求2所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤如下： 步骤一： 37℃、 5% CO2条件下， 肿瘤细胞贴壁培养至密度为80 ‑90%时， 去除细胞收集培 养液； 步骤二： 骨髓间充质干细胞贴壁培 养至密度为70 ‑80%时， 移除原有培 养液并清洗； 步骤三： 以收集到的肿瘤细胞培养液继续培养上述经过清洗的骨髓间充质干细胞； 12 ‑ 48h后收集培 养液， 超速 离心法收集外泌体沉淀 。 4.如权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 37℃、 5%  CO2条件下， 骨髓间充质干细胞 贴壁培养至密度为70 ‑80%时， 移除其原有培养液并清洗， 以收集到的肿瘤细胞培养液于37 ℃、 5% CO2条件下继续培 养48h； 48h后收集培 养液， 离心获得外泌体。 5.如权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述超速离心法是将收集到的培养液以 2000×g离心10min； 离心后吸取上清液， 10000 ×g高速离心30  min； 再次吸取上清液， 140000×g 超速离心90  min； 除去上清液， 所获得的沉淀即为外泌体， 用生理盐水洗涤 沉淀 并重悬后， 140 000×g再次离心 90 min， 适量生理盐水重悬沉淀 。 6.包含权利要求1所述外泌体的药物。 7.权利要求1所述外泌体在制备缓解癌性疼痛药物中的应用。 8.权利要求1所述外泌体在制备抑制黑素瘤细胞增殖药物中的应用， 其特征在于， 所述 外泌体是由黑素瘤 细胞培养液于37℃、 5% CO2条件下刺激骨髓间充质干细胞产生。 9.如权利要求7或8所述的应用， 其特征在于， 所述外泌体为制备癌性疼痛药物或抑制 黑素瘤细胞增殖 药物的唯一活性成分。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113846058 B 2一种骨髓间充质干细胞外泌体及其制备与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体及 其在制备缓解癌性疼痛和抑制癌细胞增殖 药物方面的应用。 背景技术 [0002]癌性疼痛 （Cancer  pain） 是疼痛部位需要修复或调节的信息传 到神经中枢后引起 的感觉， 别名， 癌痛， 晚期癌痛， 是造成癌晚期患者主要痛苦的原因之一。 在疼痛患者中， 因 各种原因使5 0%～80%的疼痛没有得到有效控制。 [0003]间充质干细胞 （Mesenchymal  stem cells, MSC） 是一种多能干细胞， 它具有干细 胞的所有共性， 即自我更新和多向分化能力。 [0004]骨髓间充质干细胞(Bone  mesenchymal  stem cells, BMSC), 既往称为骨髓 基质 成纤维细胞， 是一类起源于中胚层的成体干细胞， 具有自我更新及 多向分化潜能， 可分化为 多种间质组织， 如 骨骼、 软骨、 脂肪、 骨髓造血组织 等。 [0005]外泌体 （Exosome） 是指包含了复杂  RNA 和蛋白质的小膜泡  (30‑150nm)， 现今， 其 特指直径在40 ‑100nm的盘状囊泡。 多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。 其主要 来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体， 经多囊泡体外膜与细胞膜融合后 释放到胞 外基质中。 外泌体广泛存在并分布于各种体液中， 携带和传递重要的信号分子， 形成了一种 全新的细胞 ‑细胞间信息传递系统， 影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切 相关。 近年 来， 其应用已经 涉及肿瘤治疗领域、 医学基础和免疫领域、 化妆品领域 等。 发明内容 [0006]本发明解决的技术问题是提供一种外泌体及外泌体疗法， 作为一种新的治疗药 剂， 为当前难以治疗的癌性疼痛带来一些新的机会， 提出了在缓解癌性疼痛和抑制癌细胞 增殖方面的应用。 [0007]为了解决上述技术问题， 本发明提供的技术方案之一， 是一种骨髓间充质干细胞 分泌的外泌体， 所述外泌体是由肿瘤 细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞产生； [0008]所述肿瘤细胞包括但不限于皮肤肿瘤细胞、 软组织肿瘤细胞、 转移性骨肿瘤的原 发肿瘤细胞等； [0009]进一步地， 所述皮肤肿瘤细胞包括但不限于黑素瘤细胞、 基底细胞癌细胞、 鳞状细 胞癌细胞； [0010]进一步地， 所述软组织肿瘤细胞包括但不限于纤维肉瘤细胞、 脂肪肉瘤细胞、 平滑 肌肉瘤细胞、 淋巴管肉瘤 细胞； [0011]进一步地， 所述转移性骨肿瘤的原发肿瘤细胞包括但不限于乳癌细胞、 肺癌细胞、 肾癌细胞、 直肠癌细胞、 胰腺癌细胞、 胃癌细胞、 结肠癌细胞、 卵巢癌细胞。 [0012]本发明提供的技术方案之二， 是上述外泌体的制 备方法， 是以培养过肿瘤细胞的 培养液培养骨髓间充质干细胞后收集培 养液， 进一 步从培养液中收集外泌体；说　明　书 1/7 页 3 CN 113846058 B 3