(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111205223.8 (22)申请日 2021.10.15 (71)申请人 中国人民解 放军空军 军医大学 地址 710032 陕西省西安市新城区长乐西 路169号 (72)发明人 高源　李晓菊　张存　张英起　 李萌　郭欣燕　于金正　 (74)专利代理 机构 西安唐知 知识产权代理事务 所(普通合伙) 61284 代理人 奇敏　马睿 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01)C07K 19/00(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61K 31/44(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 搭载核酸型铁死亡诱导剂的工程化外泌体 及其构建方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种搭载核酸型铁死亡诱导剂 的工程化外泌体及其构建方法和应用。 目前已有 的铁死亡诱导剂不具有靶向性， 生物相容性较 差， 使得铁死亡诱导剂 的体内应用大大受限。 本 发明构建SP94 ‑lamp2b‑RRM融合蛋白表达载体， 然后构建带有SP94 ‑lamp2b‑RRM融合蛋白的外泌 体， 最后构建装载multi ‑siRNA的工程化外泌体， 即得搭载核酸型铁死亡诱导剂的工程化外泌体。 该工程化外泌体含有RNA结合蛋白， 能够在生物 合成过程中将大量含有RNA结合蛋白结合位点序 列的RNA包裹进入外泌体内， 进而达到载药的作 用； 装载了同时靶向GPX4和DHODH的multi ‑ siRNA， 能够有效降低细胞内GPX4和DHODH的表 达， 进而诱导细胞铁死亡； 与索拉非尼联用， 能进 一步诱导肝癌细胞铁死亡， 克服索拉非尼耐药。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 114085815 A 2022.02.25 CN 114085815 A 1.搭载核酸型铁死 亡诱导剂的工程 化外泌体的构建方法， 其特 征在于： 所述方法包括以下步骤： 步骤1： 构建S P94‑lamp2b‑RRM融合蛋白表达载体： 将SP94、 lamp2b、 RRM三个蛋白的CDS区序列通过分子克隆的方法插入到pcDNA3.1真核 生物表达载体中， 获得SP94 ‑lamp2b‑RRM融合蛋白表达载体， 并将融合蛋白表达载体转染入 293T细胞内； 步骤2： 构建带有S P94‑lamp2b‑RRM融合蛋白的外泌体： 对步骤1转染后的细 胞进行培养， 收集上清 获得带有SP94 ‑lamp2b‑RRM融合蛋白的外泌 体； 步骤3： 构建装载multi ‑siRNA的工程 化外泌体： 将SP94‑lamp2b‑RRM融合蛋白表达载体、 以及含有GPX4和DHODH  siRNA与RNA结合蛋白 结合序列的multi ‑RNA共转染至293T细胞内， 之后进行培养， 收集上清获得装载multi ‑ siRNA的工程 化外泌体。 2.根据权利要求1所述的构建方法， 其特 征在于： 所述SP94的CDS区序列为： TCTTTCTCTATTATTCATACTC CTATTCTTCCTCTT。 3.根据权利要求2所述的构建方法， 其特 征在于： 所述lamp2b的CD S区序列为： ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTG TGCGGTCTTATGCATTGGAACTTAATTTGACAGAT TCAGAAAATGCCACTTGCCTTTATGCAAAATGGCA GATGAATTTCACAGTACGCTATGA AACTACAAATAAAACTTATAAAACTGTAACCATTTCAGACCATGGC ACTGTGACATATA ATGGAAGCATTTGTGGGGATGATCAGA ATGGTCCCAAAATAGCAGTGCAGT TCGGAC CTGGCTTTTCCTGGATTGCGAATTTTACCAAGGCAGCATCTACT TATTCAATTGACAGCGTCTCAT TTTC CTACAACACTGGTGATAACACAACATTTCCTGATGCTGA AGATAAAGGAATTCTTACTGTTGATGAACTT TTGGCCATCAGAATTCCATTGAATGACCTTTTTAGATGCA ATAGTTTATCAACTTTGGAAAAGAATGATG TTGTCCAACACTACTG GGATGTTCTTGTACAAGCTTTTGTCCAAAATGGCACAGTGAGCACA AATGAGTT CCTGTGTGATA AAGACAAAACTTCAACAGTGGCACCCACCATACACAC CACTGTGC CATCTCCTACTACA ACACCTACTCCAAAGGAAAAACCAGAAGCTGGAACCTATTCAGTTAATAATGGCAATGATACT TGTCTGC TGGCTACCATGGGGCTGCAGCTGA ACATCACTCAG GATAAGGTTGCTTCAGTTATTAACATCAACCCCAA TACAACTCACTC CACAGGCAGCTGC CGTTCTCACACTGCTCTACT TAGACTCA ATAGCAGCAC CATTAAG TATCTAGACT TTGTCTTTGCTGTGA AAAATGAAAACCGATTTTATCTGAAGGAAGTGAACATCAGCATGT ATTTGGTTAATGGCTCCGTTTTCAGCATTGCAAATAACAATCTCAGCTACTG GGATGCCCCCCTGGGAAG TTCTTATATGTGCA ACAAAGAGCAGACTGT TTCAGTGTCTG GAGCATTTCAGATAAATACCTTTGATCTA AGGGTTCAGCCTTTCAATGTGACACA AGGAAAGTATTCTACAGC CCAAGAGTGTTCGCTGGATGATGACA CCATTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGAT TGCTTACGT AATTGGCAGAAGAAAAAGTTATGCTGGATATCAGACTCTG。 4.根据权利要求3所述的构建方法， 其特 征在于： 所述RRM的CDS区序列为： ATGGCAGTTCCCGAGACCCGCCCTAACCACACTAT TTATATCAACAACCTCAATGAGAAGATCAAGAAGG权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114085815 A 2ATGAGCTA AAAAAGTCCCTGTACGC CATCTTCTCCCAGTTTGGCCAGATCCTGGATATCCTGGTATCACG GAGCCTGAAGATGAGGGGCCAGGCCTTTGTCATCT TCAAGGAGGTCAGCAGCGC CACCAACGCCCTGCGC TCCATGCAGGGTTTCCCTTTCTATGACA AACCTATGCGTATC CAGTATGC CAAGACCGACTCAGATATCA TTGCCAAGATGAAAGGCACCTTCGTGGAGCGGGAC。 5.根据权利要求 4所述的构建方法， 其特 征在于： 所述multi ‑RNA的序列为： sense(5' ‑3')： GGAGUAACGAAGAGAUCA ACAAUGGGCCAUAAAUUCCGAAAU； antisense(5' ‑3')： AUUUCGGAAUUUAUGGCCCAUUGCACUUGAUCUCU UCGUUACUCC。 6.如权利要求5所述的构建方法得到的搭 载核酸型铁死 亡诱导剂的工程 化外泌体。 7.如权利要求6所述的工程 化外泌体在制备抗 肝癌药物中的应用。 8.根据权利要求7 所述的应用， 其特 征在于： 所述的工程 化外泌体能将multi ‑RNA递送给肝癌细胞， 诱 导肝癌细胞铁死 亡。 9.如权利要求6所述的工程 化外泌体联合索拉非尼在制备抗 肝癌药物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于： 所述的工程 化外泌体能与索拉非尼协同诱 导肝癌细胞铁死 亡。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114085815 A 3