(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111011631.X (22)申请日 2021.08.31 (71)申请人 杭州师范大学 地址 311121 浙江省杭州市余杭区仓前街 道余杭塘路2318号 (72)发明人 孔娜　谢恬　 (74)专利代理 机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 代理人 刘元慧 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61K 47/24(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 35/04(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) (54)发明名称 p53及UTX信使RNA纳米粒的制备方法及该信 使RNA的应用 (57)摘要 本发明公开了一种p53及UTX信使RNA纳米粒 制备方法及其在膀胱癌治疗中的应用， 属于基因 工程技术领域。 肿瘤抑癌基因信使RNA纳米粒通 过下述方法制备： 1） 体外合成化学修饰p53 ‑mRNA 及UTX‑mRNA， 2） 制 备脂质聚合物复合信使RNA纳 米粒。 本发明中p53、 UTX信使RNA成功通过纳米体 系递送至膀胱癌细胞内， 在体内外高效快速地诱 导细胞凋亡和抑制促转移因子的表达从而显著 抑制了肿瘤细胞的生长及转移； 具有膀胱粘膜粘 附功能的RNA纳米粒递送体系可以增加膀胱内 p53‑mRNA及UTX ‑mRNA药物停留时间从而使得信 使RNA进入肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。 权利要求书2页 说明书11页 附图6页 CN 113925975 A 2022.01.14 CN 113925975 A 1.p53‑mRNA及UTX‑mRNA纳米粒的制备 方法， 其特 征在于该制备 方法包括以下步骤： 1） 体外合成化学修饰p5 3‑mRNA及UTX‑mRNA 携带T7启动 子的人p53及UTX基因开放阅读框质粒形成线性化DNA， 再采用PCR扩增包含 T7启动子的p53及UTX开放阅读框， 并对PCR产物进行纯化， 得到纯化的聚合酶链式反应产 物； 将MEGAscript ®T7转录试剂盒与纯化的聚合酶链式反应产物、 3 ′ ‑O‑Me‑m7G(5′)ppp (5′)G帽结构类似物、 三磷酸鸟苷、 5 ‑甲基‑胞苷三磷酸、 三磷酸腺苷和假尿苷 ‑5’ ‑三磷酸反 应， 反应完成后进行脱 氧核糖核酸 酶处理,再使用  poly(A)试剂盒将3 ’poly(A)试剂盒添加 到IVT RNA转录物中， 得到p5 3/UTX信使RNA； p53/UTX信 使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶处理以及进一步纯化得到所 需mRNA； 2） 制备脂质聚合物复合信使RNA纳米粒 取PAMAM树枝状聚合物G0和1,2 ‑环氧十四烷， 合成阳离 子脂质G0‑C14； 采用优化的自组装策略， 将步骤1） 得到的mRNA与G0 ‑C14 DMF混合， 形成mRNA/G0 ‑C14络 合物， 再在5  mg/ml的 DMF中快速加入25 0g PLGA， 与配合物混合， 达 到均匀混合溶 液； 磁力搅拌下， 将混合溶液滴入10毫升无核酸的HyPure水， 其中1mg  DSPE‑PEG‑NH2、 或者 1mg DSPE‑PEG‑NH2/DSPE ‑PEG‑SH混合物、 或者1mg  DSPE‑PEG‑SH构建得到NP s的脂质PEG外 层； 经自组装稳定后， 形成的NP s用预冷的无酶纯水使用Amicon过滤管冲洗， 去除游离化合 物和有机溶剂， 洗涤后的纳米粒沉淀用PBS重悬成不同浓度的黏附型mRNA  NPs， 得到p53 ‑ mRNA及UTX‑mRNA纳米粒。 2.如权利要求1所述的p53 ‑mRNA及UTX ‑mRNA纳米粒的制备方法， 其特征在于步骤1） 中 化学修饰反应体系具体为： 纯化的聚合酶链式反应产物 的添加量为1 ‑2μg， 3′ ‑O‑Me‑m7G (5′)ppp(5′)G帽结构类似物的添加量为6mM、 三磷酸鸟苷的添加量为1.5mM、 5 ‑甲基‑胞苷三 磷酸的添加量为7.5mM、 三磷酸腺苷的添加量为7.5mM、 假尿苷 ‑5’ ‑三磷酸的添加量为 7.5mM， 反应温度为37℃， 反应时间为 4小时。 3.如权利要求1所述的p53 ‑mRNA及UTX ‑mRNA纳米粒的制备方法， 其特征在于步骤1） 中 热敏磷酸酶处 理温度为37℃， 处 理时间为3 0分钟。 4.如权利要求1所述的p53 ‑mRNA及UTX ‑mRNA纳米粒的制备方法， 其特征在于步骤2） 自 组装策略中， mRNA  16 μg与G0 ‑C14 250 μg进行混合15s， 其中， mRNA的浓度为1mg/ml， G0 ‑C14  的浓度为2.5  mg/ml。 5.如权利要求1所述的p53 ‑mRNA及UTX ‑mRNA纳米粒的制备方法， 其特征在于步骤2） 中 DSPE‑PEG‑NH2/DSPE‑PEG‑SH混合物的重量比为1： 1。 6.利用权利要求1 ‑5任一所述方法得到的p53 ‑mRNA及UTX ‑mRNA纳米粒在制备治疗肿瘤 药物中的应用。 7.如权利要求6所述的应用， 其特征在于所述治疗肿瘤药物为恢复p53及UTX抑癌功能 的药物。 8.如权利要求7所述的应用， 其特征在于所述恢复p53及UTX抑癌功能的药物具体为在 膀胱癌中恢复p5 3、 UTX抑癌功能的药物。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113925975 A 29.如权利要求6所述的应用， 其特征在于所述治疗肿瘤药物具体通过具有膀胱粘膜粘 附功能的RNA纳米粒增加 膀胱内p53 ‑mRNA及UTX ‑mRNA药物停留时间从而使得信使RNA进入 肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113925975 A 3