(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110900856.4 (22)申请日 2021.08.0 6 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113398264 A (43)申请公布日 2021.09.17 (73)专利权人 朱有建 地址 830002 新疆维吾尔自治区乌鲁 木齐 市沙依巴克区巴州路15号A座1单元 201室 专利权人 新疆新诺方舟健康管理有限公司 (72)发明人 王京　钟桂华　 (74)专利代理 机构 南京中高专利代理有限公司 32333 代理人 卢丹丹(51)Int.Cl. A61K 39/395(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61K 9/72(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C07K 16/28(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) 审查员 徐丹 (54)发明名称 NK细胞及其组合物在治 疗癌症中的用途 (57)摘要 本发明涉及NK细胞及其组合物在治疗癌症 中的用途。 本发明提供一种特异性针对V EGFR2蛋 白的VEGF R2单克隆抗体， 同时分离制备得到了高 活性的NK细胞， 二者分别针对肝癌细胞均具有较 好的抑制活性， 同时将所述单克隆抗体与NK细胞 一起使用能够有效的抑制肝癌肿瘤的生长， 具有 较好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 113398264 B 2022.04.29 CN 113398264 B 1.特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体和NK细胞在制备用于治疗肝癌的药盒中的用途； 其 特征在于， 其中， 所述单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ  ID NO:1所示， 轻链可变区序列 如SEQ ID NO:2所示； 其中NK细胞采用如下的方法制备 获得： 将外周血2000r/min离心10min 后小心吸出血浆， 56℃水浴灭活30min， 备用;血细胞用生理盐水稀释后加至装有Ficoll溶 液的离心管中， 2000r/min离心20min收集白膜层细胞并用生理盐水洗涤， 计数备用； 用GT ‑ T551H3培养基将2 ×107个PBMCs重悬后， 接入T75细胞培养瓶， 然后向体系中加入IL ‑2、 白藜 芦醇、 NK滋养细胞及自体血浆， 其中， IL ‑2为500U/mL、 白藜芦醇终浓度为2 μmol／L、 滋养细胞 为1×106mL  ‑1， 血浆体积为5%， 37℃5%CO2条件下体外共培养15d， 其中培养第7天时补加一次 NK扩增滋养细胞， 补加的NK扩增滋养细胞的数量为NK细胞数量的1/4； 培养过程中每天对NK 细胞观察计数， 当NK细胞密度超过2.5 ×106cells/mL补充培养基， 补加的培养基为含有 240U/mL IL‑2的GT‑T551H3培养基， 补液后密度维持在1.0 ×106cells/mL， 共培养15d， 收集 细胞即得到高活性的NK细胞。 2.如权利要求1所述的用途， 其特 征在于所述药盒中还 含有药学上可接受的载体。 3.如权利要求1所述的用途， 其特 征在于所述药盒中包 含至少一种赋 形剂。 4.如权利要求3所述的用途， 其特征在于所述药盒中的赋形剂选自组氨酸， 海藻糖， 甘 露醇， 蔗糖或柠檬酸钠。 5.如权利要求3所述的用途， 其特 征在于所述药盒中包 含缓冲液。 6.如权利要求5所述的用途， 其特征在于所述药盒中的缓冲液为组氨酸， 甘氨酸或磷酸 缓冲液。 7.特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体， 其特征在于， 所述单克隆抗体的重链可变区序列 如SEQ ID NO:1所示， 轻链可变区序列如SEQ  ID NO:2所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113398264 B 2NK细胞及其组合物在治疗癌症中的用途 技术领域 [0001]本发明涉及生物领域， 更具体的涉及一种NK细胞及其组合物在治疗癌症中的用 途。 背景技术 [0002]肝癌是世界上常见的恶性肿瘤之一， 每年全世界死于肝癌的患者估计达125万， 而 我国是肝癌高发区， 因此研究肝癌的诊断和治疗具有重要的意义。 自1975年Kohler和 Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来， 各种单克隆抗体(McAb)相继出现， 它们在疾病诊 治的基础研究和临床 应用方面发挥了积极的作用， 其中肝癌单抗的研制更是为这种难治性 肿瘤带来了新的希望 。 [0003]肝癌单抗研究大多为甲胎蛋白， 铁蛋白单抗， 肝癌单抗研究很少， 在肝癌单抗的制 备方面， 多 数采用传统的方法， 即以可溶性物质或肝癌培养细胞为免疫原， 由于肿瘤抗原的 变异或部 分丢失， 因而 该方法难以获得高亲和性、 高特异 性的单抗。 用肿瘤新鲜组织制备细 胞悬液免疫动物制备单抗已有成功报道， 该法虽然筛选麻烦， 但能较好地保持抗原 性， 不失 为制备单抗的好方法， 用该方法融合获得特异 性肝癌单抗， 其中特异 性较好的HAb18肝癌免 疫组化染色阳性率为75％， 已通过了中国药品生物制品检定所的 《人用鼠源性单克隆抗体 制备及质量控制要点》 的要求。 此外， 中科院上海细胞所谢弘报道了一株鼠抗人原发性肝癌 (PHC)细胞膜抗体Hepama ‑I， 研究证明对PHC细胞有较高的亲和力。 这些均为我国肝癌单抗 的深入研究增添了信心。 [0004]以单抗为载体的导向化疗， 放疗及放免显象诊断， 近年取得了实质性进展。 ①化学 药物—单抗交联物： 国内外用于交联的抗癌药物有数十种， 主要有MTX， MMC， DM， AM等， 依肿 瘤类别选择。 谢弘用Hepama ‑I IgG‑BSA‑MTX对肝癌细胞的IC50值为8 ×10‑8M， 而对Hela细 胞的IC50值只有3 ×10‑6M；②细胞毒素—单抗交联物： 用于制备细胞毒 素的有蓖麻毒蛋白， 天花毒蛋白， 白喉毒素， 植物毒蛋白， A链类似的致核糖体失活蛋白； ③同位素—单抗交联 物： 由于肿瘤抗原的不均一 性， 抗体不能到 达肝癌细胞， 因此用特异性 放疗， 效果比化疗好。 [0005]抗体导向化疗可改变药物在体内自然分布， 造成药物在瘤 区浓集， 从而发挥其特 异性杀伤作用。 张尚权等研 究了抗肝癌单抗Hepama ‑I丝裂霉素结合物， 经荷瘤裸鼠动物实 验表明， 该导向化疗药物较单 纯的化疗有明显的亲和性， 是其应用的前提和关键 。 [0006]用放射性核素标记单抗制备而 成的放免显象剂和治疗剂已成为肿瘤早期诊断， 综 合治疗及术后清扫的有力手段之一。 截止目前， 美国约有近十种显象剂和治疗剂通过FDA， 进入I， II期临床验证阶段， 但尚无一种针对肝癌的制剂， 国内这方面的研究已初露端倪。 施 乐华报道了131I ‑Hepama‑I经股动脉介入放免定位及 治疗30例失去手术指征的原发性肝癌 患者的研究， 显象率为14/18， 很优等显象时间在注 射后96h， AFP下降率为75.0％， 肿瘤部分 缩小率66。 6％， 与对照组比较， 生存时间明显延长， 认 为核素碘标记的Hepama ‑Ⅰ肝癌单抗可 作为治疗晚期肝癌的综合疗法之一。 肝癌单抗HAb18也得到了广泛的应用研究， 其中131I ‑ HAb18放免显象剂和导 向治疗剂均已通过国家一类新药评审， 获得临床批号进入I， II期临说　明　书 1/7 页 3 CN 113398264 B 3