(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110768590.2 (22)申请日 2021.07.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113527514 A (43)申请公布日 2021.10.2 2 (66)本国优先权数据 202110739693.6 2021.0 6.30 CN 202110739303.5 2021.0 6.30 CN (73)专利权人 徐州医科 大学 地址 221004 江苏省徐州市 云龙区铜山路 209号 (72)发明人 王刚　郑骏年　李慧忠　刘鎏　 郭增礼　(74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 朱萍　孟祥斌 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) 审查员 刘俊 (54)发明名称 Gstp1在制备增效型CAR-T中的应用 (57)摘要 本发明公开了Gstp1在制备增效型CAR ‑T中 的应用。 具体公开了一种抑制T细胞活性氧 (Reactive  oxygen species， ROS)的CAR ‑T细胞、 及其构建方法和应用， 所述CAR ‑T中的CAR包含 B7H3抗原结合结构域、 跨膜结构域、 胞内信号结 构域以及GS TP1基因， 制备得到的CAR ‑T不仅对表 达B7H3的肿瘤细胞具有高效的杀伤能力， 而且高 表达GSTP1后的CAR ‑T能够抑制其自身ROS的产 生， 进一步增强CAR ‑T细胞的杀伤功能， 可针对广 谱的实体肿瘤， 应用范围广， 不但对本领域具有 较高的参 考价值， 而且具有良好的应用潜力。 权利要求书5页 说明书11页 序列表13页 附图3页 CN 113527514 B 2022.07.15 CN 113527514 B 1.一种嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、 跨膜结构域、 胞内信号结构域和抑制ROS的结构域依次串联而成； 所述拮抗ROS的结构域 为人源GSTP1； 所述胞外结构域包括与B7H 3特异性结合的抗体scFv； 所述scFv的氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 2.根据权利要求1所述的嵌合 抗原受体， 其特 征在于， 所述胞外结构域还 包括铰链区。 3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述铰链区包含选自CD8α， CD28， 4‑1BB， PD‑1、 CD34、 OX40， CD3 ε、 IgG1、 IgG4蛋白质的铰链区。 4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述铰链区为CD8α 蛋白质的铰链 区。 5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述铰链区的氨基酸序列为如 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。 6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述胞外结构域还包括胞外信号 肽。 7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述胞外信号肽包含选自CD8、 CD45、 CD3ζ、 CD28、 CD3 ε、 CD45、 CD16、 CD22、 CD33、 CD37、 CD64、 CD4、 CD5、 CD9、 CD80、 CD86、 ICOS、 CD154、 GITR、 CD134、 CD137、 GM ‑CSF、 IgG6信号肽。 8.根据权利要求7 所述的嵌合 抗原受体， 其特 征在于， 所述胞外信号肽为 IgG6信号肽。 9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述胞外信号肽的氨基酸序列为 如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。 10.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述跨膜结构域包含选自T细胞 受体的α、 β 或ζ链、 CD28、 CD3ε、 CD45、 CD4、 CD5、 CD8、 CD8α、 CD9、 CD16、 CD22、 CD33、 CD37、 CD64、 CD80、 CD86、 CD134、 CD137、 CD154蛋白质的跨膜结构域。 11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述跨膜结构域为CD8α 的跨膜 结构域。 12.根据权利要求11所述的嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述跨膜结构域的氨基酸序列 为如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。 13.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述胞内信号结构域包括信号 转导结构域。 14.根据权利要求13所述的嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述信号转导结构域包含选自 CD3ζ、 TCRζ、 FcRγ、 FcRβ 、 CD3γ、 CD3δ、 CD3ε、 CD5、 CD22、 CD 79a、 CD79b、 CD278、 FcεRI、 DAP10、 DAP12、 CD6 6d的功能性信号传导结构域。 15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述信号转导结构域为CD3ζ 的 功能性信号传导结构域。 16.根据权利要求15所述的嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述信号转导结构域的氨基酸 序列为如SEQ  ID NO:5所示的氨基酸序列。 17.根据权利要求13所述的嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述胞内信号结构域还包括共 刺激信号结构域。 18.根据权利要求17所述的嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述共刺激信号结构域包含选 自CD2、 CD7、 CD27、 CD28、 CD30、 CD40、 OX40、 CDS、 ICAM ‑1、 4‑1BB(CD137)、 B7 ‑H3、 ICOS(CD278)、权　利　要　求　书 1/5 页 2 CN 113527514 B 2GITR、 BAFFR、 LIGHT、 HVEM(LIGHTR)、 KIRDS2、 SLAMF7、 NKp80(KLRF1)、 NKp30、 NKp46、 CD19、 CD4、 CD8α 、 CD8β 的功能性信号传导结构域。 19.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述共刺激信号结构域为4 ‑ 1BB的功能性信号传导结构域。 20.根据权利要求19所述的嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述共刺激信号结构域的氨基 酸序列为如SEQ  ID NO:6所示的氨基酸序列。 21.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述拮抗ROS的结构域的氨基酸 序列为如SEQ  ID NO:7所示的氨基酸序列。 22.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述嵌合抗原受体还包括自裂 解肽T2A。 23.根据权利要求22所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述自裂解肽T2A的氨基酸序 列为如SEQ  ID NO:8所示的氨基酸序列。 24.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述嵌合抗原受体由IgG6信号 肽、 scFv、 CD8α 的铰链区、 CD8α 的跨膜结构域、 4 ‑1BB的功能性信号传导结构域、 CD3ζ 的功能 性信号传导结构域、 自裂解肽T2 A、 人源GSTP1依次串联 得到。 25.根据权利要求24所述的嵌合抗原 受体， 其特征在于， 所述嵌合抗原 受体的氨基酸序 列为如SEQ  ID NO:9或SEQ  ID NO:10所示的氨基酸序列。 26.一种核酸分子， 其特征在于， 所述核酸分子包括编码权利要求1 ‑25中任一项所述的 嵌合抗原受体的核酸分子 。 27.根据权利要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述scFv的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:11所示。 28.根据权利要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述CD8α铰链区的核苷酸序列如 SEQ ID NO:12所示。 29.根据权利要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述IgG6信号肽的核苷酸序列如 SEQ ID NO:13所示。 30.根据权利要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述CD8α 跨膜结构域的核苷酸序列 如SEQ ID NO:14所示。 31.根据权利要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述CD3ζ信号转导结构域的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:15所示。 32.根据权利要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述4 ‑1BB共刺激信号结构域的核 苷酸序列如SEQ  ID NO:16所示。 33.根据权利要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述自裂解肽T2A的核苷酸序列如 SEQ ID NO:18所示。 34.根据权利 要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述人源GSTP1的核苷酸序列如SEQ   ID NO:17所示。 35.根据权利要求26所述的核酸分子， 其特征在于， 所述编码权利要求1所述嵌合抗原 受体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ  ID NO:19或SEQ  ID NO:20所示。 36.一种核酸构建物， 其特征在于， 所述核酸构建物含有权利要求26 ‑35中任一项所述 的核酸分子 。权　利　要　求　书 2/5 页 3 CN 113527514 B 3