ICS 65.020.01 B 15 DB23 黑龙江省地方标准 DB 23/ T 2374—2019 马铃薯胞囊线虫田间调查技术规范 2019-06-05 发布 2019-07-04 实施 黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局      发 布 DB23/T 2374—2019 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009的规则编写。 本标准由黑龙江省农业农村厅提出。 本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：黑龙江省农业科学院马铃薯研究所。 本标准主要起草人：王文重、闵凡祥、胡林双、高云飞、杨帅、魏琪、董学志、郭梅、宿飞飞。 I DB23/T 2374—2019 马铃薯胞囊线虫田间调查技术规程 1　范围 本标准规定了马铃薯胞囊线虫田间调查的土壤取样、分离、鉴定和结果判断方法。 本标准适用于马铃薯胞囊线虫田间调查。 2　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1　 马铃薯胞囊线虫 马 铃 薯 胞 囊 线 虫 （ potato cyst nematode ） 包 括 马 铃 薯 白 线 虫 （ Globodera rostochiensis）和马铃薯金线虫（Globodera pallida），属于线虫门（Nemata）、侧尾腺 纲（Secernentea）、垫刃目（Tylenchida）、异皮线虫科（Heteroderidae）胞囊线虫属 （Heterodera)，是马铃薯作物上最重要的病害之一。对马铃薯根部、匍匐茎和块茎造成伤 害，症状主要表现为坏死，影响根部生长，阻碍养分吸收，降低马铃薯产量和商品性。 3　取样时间和方法 3.1　 取样时间 每年在马铃薯播种前或收获后，对马铃薯田土壤进行随机取样。 3.2　 调查地块 根据当地不同土壤类型选择有代表性的地块进行调查，每块面积不得小于6670 m2。 3.3　 调查方法 取样时首先填写表1。 表1　马铃薯胞囊线虫田间调查表 取样地点 取样时间 样品编号 调查面积（m2） 土壤类型 填表人 前茬作物 备注 2 DB23/T 2374—2019 取样时先去除3 cm~5 cm的表土，然后利用土壤取样器采集土壤样品。由于马铃薯属于垄 作，所以取样时取距地面 15 cm~20 cm的根部土壤。采用对角线五点取样法，每个地块可取 5个取样点，每个取样点挖取根围土作为1个小样，每个小样100 g，然后将其混合成一个500 g的混合样。写好标签，将样品装入取样袋中。取样时应在土壤湿润时进行，避免在土壤浸 水时取样。 4　分离和鉴定 4.1　 样品分离 将取回的土壤样品平铺在干净的浅瓷盘内，自然干燥，去除土壤中的植物组织和粗砂等 杂质后，称取100 g土壤样品备用。 采用胞囊漂浮器分离法，分离时先将漂浮筒注满水，将干燥后的100 g土壤样品放在上 筛中，用强水流冲洗至全部土样到漂浮筒内，胞囊和草屑等浮在水面并溢出，经环颈水槽流 到底筛中，用清水反复冲洗底筛，将底筛中的漂浮物倒在铺有滤纸的漏斗中过滤，胞囊留在 滤纸上。将晾干后的滤纸放于解剖镜（8倍~10倍）下检查，寻找胞囊。发现胞囊后用小毛刷 收集胞囊。 4.2　 样品制作 将胞囊线虫的胞囊在培养皿内浸泡24 h，用尖头镊子将浸过的胞囊移至载玻片的水滴中， 在体视显微镜（10倍~90倍）下用解剖刀切下胞囊后部的阴门椎部分。用挑针清除阴门椎内 附着物，用刀适当整理阴门椎边缘，使其高度不超过阴门窗区域宽度的10倍~15倍。将切下 的阴门椎用40%的H2O2处理数分钟，阴门椎依次移至载玻片的另一侧的70%、95%、100%酒精 液中脱水。取适量固体状的中性胶涂至凹槽的载玻片中，在酒精灯上加热至胶溶化，将处理 好的阴门埋于胶内，注意操作时一定摆正阴门椎使其顶端向上，加入刷子毛作支撑物，盖上 盖玻片，贴好标签。 4.3　 样品鉴定 制作胞囊线虫阴门锥玻片。最后生物显微镜（100倍~1000倍）下观察胞囊和阴门锥形态 特征。参见附录A，对马铃薯胞囊线虫形态进行鉴定。 5　 结果判断 符合4.3形态鉴定特征可判定是否分离到马铃薯金线虫和马铃薯白线虫，最后将结果汇 入表2，判断该地区是否存在马铃薯胞囊线虫。 表2　马铃薯胞囊线虫田间调查情况及结果表 结果 样品编号 取样时间 +：表示有；—表示没有 马铃薯金线虫 马铃薯白线虫 备注 A 3 DB23/T 2374—2019 附　录　A （资料性附录） 马铃薯胞囊线虫形态特征 A.1　 马铃薯白线虫 学名：Globodera rostochiensis 异 名 ： Heterodera schachtii rostochiensis ； H. schachtii solani ； H. rostochiensis 英文名：Potato cyst nematode；White potato cyst nematode 分类：线虫动物门（Nematoda），侧尾腺口纲（Secernentea），垫刃目（Tylenchida）， 异皮线虫科（Heteroderidae），球胞囊属（Globoder）。 形态学特征：成熟雌虫呈白色，死后变为褐色、有光泽，有些种群在变成褐色之前要经 过3~4周的米黄色阶段。虫体近球形，有一个突出的颈和头部；末端钝圆、无阴门锥，角质 层有网状花纹；头架骨化弱，口针强壮，针锥部长占口针长的1/2，基部球向后倾斜，口腔 内衬形成一个口针导管从头架延伸到约口针长的75%处。中食道球发达，中食道球瓣大、呈 新月形；食道腺叶宽，位置不定，有3个核。排泄孔大，位于颈基部。双生殖腺，阴门横裂、 位于略凹陷的阴门盆内，阴门两边为小瘤状突起形成的新月形区，肛门和阴门盆之间角质层 上约有12条隆起的脊，其中有些交接成网状。胞囊：褐色，有光泽，近球形，有突出的颈； 角质层花纹比雌虫更清晰，角质层下无亚结晶层；阴门区有1个环形膜孔，无阴门桥、阴门 下桥及其他内生殖器残留物，无泡囊，但有类似泡囊状物存在。 该线虫属于检疫性害虫。 雌虫（n=25）：口针长=26.0 μm ±1.6 μm；背食道腺开口距口针基部=6.0 μm ±1.1 μm；唇区至排泄孔=143.9 μm ±21.9 μm；阴门裂长=11.1 μm ±1.6 μm；肛门至阴门盆距 离=43.2 μm ±8.8 μm；肛阴间轴线上的角质层脊数=8~12条。 胞囊（n=25）：长（不包括颈）=510 μm ± 69 μm；宽=451 μm ± 76 μm；颈长=111 μm ± 26 μm。 雄虫（n=25）：L=1197μm±100 μm；口针长=25.8 μm ± 0.9 μm；背食道腺开口至 口针基部距离=5.3 μm ± 0.9 μm；交合刺长=35.5 μm ± 2.8 μm；引带长=10.3 μm ±1.5 μm。 二龄幼虫（n=25）：L（除颈长）=482±1.8 μm；体宽=23.4±0.6 μm；尾透明部长 =26.6±3.4 μm；口针基部球到背食道腺口=2.9±0.9 μm；尾长=52.6±4.1 μm。 A.2　 马铃薯金线虫 学名：Globodera pallida 异名：Heterodera pallida 英文名：potato cyst nematode；potato golden nematode 分类：线虫动物门（Nematoda），侧尾腺口纲（Secernentea），垫刃目（Tylenchida）， 异皮线虫科（Heteroderidae），球胞囊属（Globoder）。 形态学特征：虫体亚球形，颈突出（包括食道和食道腺的一部分）；头小，上有1或2条 明显的环纹，与颈上深陷且不规则的环交融在一起。球形身体的大部分被角质覆盖且表面具 有网状脊的纹饰，无侧线，六角放射状的头轻度骨化。口针前部约为口针长的50%，且有时 轻度弯曲。在固定的标本中，口针前部常与口针后部相脱离。口针基球圆形，后部明显下斜。 4 DB23/T 2374—2019 口道从头架的基部盘向后延伸，到口针长度的75%处形成一个管状的口针腔。中食道球大， 具发达的新月形的瓣门。食道腺位于一大的裂片上，常被已发育好的成对的块状卵巢覆盖。 排泄孔明显，位于颈基部附近。颈区无色的体表分泌物常使内部器官看不清。阴门区和尾区 不缢缩，位于阴门盆的一个近圆形的轻度凹陷的区域。阴门盆外是肛门；在阴门和肛门间的 表皮形成了约20条平行的脊，这些脊略有一些交叉。在阴门—肛门区外这些脊变成网状的 纹饰；这些纹饰覆盖了除颈以外体表的其他部分，在身体的大部分均可见到不规则的精细的 亚表皮刻点。胞囊线虫从根部的皮层突出时呈现白色，然后由于色素积累，经过4～6周金黄 色阶段后，雌虫死亡，角质随即变成深棕色，因此，此线虫俗名称作“金线虫”。 胞囊：亚球形，上有突出的颈，没有突出的阴门锥。双半膜孔。新胞囊上阴门区完整， 但在老标本中，阴门盆的全部或部分丢失，只形成单一圆形的膜孔。无阴门桥、下桥、无泡 状突；但在一些胞囊的阴门区可能存在小块不规则的黑色素沉积区及局部加厚。胞囊上的纹 饰与雌虫上的相像，但比雌虫更明显，无亚晶层。 雄虫：蠕虫形，温和热杀死时虫体强烈弯曲；体后部纵向扭曲90°～180°，呈现“C” 形或“S”形。尾短且末端钝圆。角质层表面有规则的环，尾末端侧区有4条侧线；环纹穿过 外侧侧线，但不穿过内侧侧线。头圆，缢缩，有6～7条环纹；口盘大，有6片小唇瓣环绕。 唇瓣侧面有侧器孔。头呈六角放射状，深度骨化。口针发达，口针基球向后倾斜，前部分占 整个口针长度的45%。中食道球椭圆形，上有一明显的新月形瓣门。中食道球与肠中间有一 宽大的神经环环绕食道；无明显的食道—肠间瓣膜。食道腺位于腹面排泄孔附近一窄的裂片 上。排泄孔位于头端大约15%体长处。背腺核明显；亚腹腺核位于食道腺体后部，不明显； 半月体2个体环长，位于排泄孔前；半月小体1个体环长，在排泄孔后9～12体环处。单精巢 自身体中部开始，中间为具腔和腺壁的输精管，后部圆锥形。泄殖腔孔小；交合刺粗大，弓 形，远末端有一尖的顶部；交合刺背面存在小的无纹饰的引带；引带约为2 μm厚。 二龄幼虫：蠕虫形，尾圆锥形，逐渐变细，末端细圆。尾后部1/2至2/3处为透明区。角 质环纹明显；侧区有4条侧线，从3条侧线开始，偶尔以网状结束。头部轻度缢缩，圆形，有 4～6条环纹；头架深度骨化，六角放射状。口针发达，口针基球圆，略微向后倾斜。排泄孔 大约在头后20%的体长处；半月体2个体环宽，位于排泄孔前1个体环处。半月小体宽度至少 是一个体环，在排泄孔前5～6个体环处。在体长的约60%处有4个细胞的生殖腺原基。 该线虫属于检疫性害虫。 雌虫（n=25）：口针长度=22.9±1.2 μm，口针基部到背食道腺开口的距离=5.7±0.9 μm，头基部宽=5