ICS 65.120 B 46 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1594—2019 青贮饲料中微生物数量测定方法 Code for measuring microorganism counts in silage 2019-02-20 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-05-20 实施 发 布 DB15/T 1594—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 方法 .............................................................................. 2 5 仪器设备 .......................................................................... 2 6 培养基和试剂 ...................................................................... 2 7 测定程序 .......................................................................... 3 8 分析步骤 .......................................................................... 3 9 微生物数量计算 .................................................................... 3 附录 A（资料性附录） 培养基 .......................................................... 4 I DB15/T 1594—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学、中国农业科学院草原研究所、沈 阳农业大学、内蒙古草都饲草料研究院、内蒙古自治区草原勘察规划院。 本标准主要起草人： 孙林、薛艳林、格根图、张福金、殷国梅、孙杰、赵和平、孙娟娟、白春生、 王志军、羿静、张欣昕、刘广华、范文强、张园园、刘思博、张琼琳。 II DB15/T 1594—2019 青贮饲料中微生物数量测定方法 1 范围 本标准规定了青贮饲料中乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌数量测定的方法、仪器设备、培 养基和试剂、测定程序、分析步骤、数量计算。 本标准适用于内蒙古地区青贮饲料中微生物数量测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 术语和定义 3.1 青贮饲料微生物 microorganism in silage 青贮饲料中的乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌等微生物。 3.2 乳酸菌数量 lactic acid bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得 1 g 试样中所含乳酸菌数 量。 3.3 大肠杆菌数量 coliform bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1 g试样中所含大肠杆菌 的数量。 3.4 细菌数量 bacteria count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1 g试样中所含好氧细菌 数量。 1 DB15/T 1594—2019 3.5 霉菌数量 moulds count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1 g试样中含霉菌数量。 3.6 酵母菌数量 yeasts count 青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1 g试样中含酵母菌数量。 3.7 菌落形成单位 colony-forming units，CFU 在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算微生物数量的单位。 4 方法 根据青贮饲料中微生物生理特性，选择分别适宜于真菌、细菌、大肠杆菌和乳酸菌生长的培养基， 采用平板计数方法，测定微生物数量。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 分析天平，感量 0.001 g。 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 2 高压灭菌器：灭菌压力 0-3 kg/cm 。 振荡器：往复式。 涡旋震荡器：2900 r/min。 灭菌玻璃三角瓶：250 mL，500 mL。 灭菌试管：15 mm×150 mm。 灭菌培养皿：直径 90 mm。 灭菌吸管：1 mL，10 mL。 灭菌玻璃珠：直径 5 mm。 水浴锅：（45～77）℃±1 ℃。 超净工作台。 6 培养基和试剂 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 2 乳酸菌培养基：MRS 琼脂，见附件 A.1。 大肠杆菌培养基：结晶紫中性红胆盐琼脂，见附件 A.2。 细菌培养基：营养琼脂，见附件 A.3。 霉菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，见附件 A.4。 酵母菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，见附件 A.4。 稀释液：称取氯化钠 8.5 g，溶于 1000 mL 蒸馏水中，分装后，121 ℃高压灭菌 30 min。 除特殊注明，所用试剂均为分析纯；水符合 GB/T 6682 三级水规格。 DB15/T 1594—2019 6.8 实验室常用消毒试剂。 7 测定程序 青贮饲料微生物数量测定程序图见图1。 图1 青贮饲料微生物数量测定程序图 8 分析步骤 8.1 按照 GB/T 14699.1 中的规定执行，采样时注意样品的代表性和避免污染。 8.2 菌液制备 以无菌操作称取 25 g 青贮样品放入装有 225 mL 灭菌稀释液的玻璃三角瓶中，封口后置 振荡器上，振荡 30 min，即为 1:10 的菌液。 8.3 用灭菌吸管吸取 1:10 菌液 10 mL，注入灭菌试管中，置涡旋震荡器上混合 3 min，使微生物充分 分散成单个细胞。 8.4 用灭菌吸管吸取 8.3 的菌液（1:10）1 mL，注入含有 9 mL 灭菌稀释液试管中，置涡旋震荡器上混 合 1 min，此液为 1:100 菌液。 8.5 按照上述操作顺序作 10 倍递增稀释，每稀释一次，换用一支 1mL 灭菌吸管；根据对样品情况的估 计，选择三个合适稀释度；吸取 1 mL 所选稀释度菌液于灭菌培养皿中，每个稀释度作两个培养皿。 8.6 菌液移入培养皿后，应及时将凉至 45 ℃至 60 ℃的培养基注入培养皿约 15 mL 并转动培养皿使混 合均匀。 8.7 待培养基凝固后，翻转培养皿，倒置于恒温（乳酸菌：30 ℃厌氧，大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母 菌：30 ℃）培养箱中，培养 24 h 至 96 h（乳酸菌：72 h，霉菌和酵母菌：96 h，大肠杆菌：24 h， 细菌：96 h）后开始观测计数。 8.8 选取乳酸菌、大肠杆菌、细菌或酵母菌等菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间的培养皿进行计数，选 取霉菌菌落数在 10 CFU～100 CFU 之间的培养皿进行计数；每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均 数。 9 微生物数量计算 青贮饲料中乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌数量按公式（1）计算： N = (C×10 n-1×250)/25…………………………………………（1） 式中: N——每克青贮饲料中微生物数量，单位为CFU/g； C——相同稀释度两个培养皿上菌落数的平均值； n——稀释度。 3 DB15/T 1594—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 培养基 A.1 MRS琼脂 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温80 1.0 mL K2HPO4•7H2O 2.0 g 醋酸钠•3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO4•7H2O 0.2 g MnSO4•4H2O 0.05 g 琼脂粉 15.0 g A.1.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.2±0.2，分装后121 ℃高压灭菌15 min。 A.2 结晶紫中性红胆盐琼脂 A.2.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏粉 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 3号胆盐 1.5 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15.0 g A.2.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，煮沸不要超过2 min，调节pH至pH 7.4±0.2。 4 DB15/T 1594—2019 A.3 营养琼脂 A.3.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g A.3.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至7.3 ± 0.1，分装后121 ℃高压灭菌15 min。 A.4 马铃薯葡萄糖琼脂 A.4.1 成分 马铃薯 200.0 g 葡萄糖 20.0 g 琼脂 20.0 g A.4.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，加热溶解，分装后121 ℃高压灭菌15 min。 __________________________