ICS  11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3121—2018 Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测 技术规程 Technical Regulations of PCR Assay for Detection of Fowl Aviadenovirus Serotype 4 Nucleic Acid 文稿版次选择 2018 - 04 - 16 发布 安徽省质量技术监督局 2018 - 05 - 16 实施 发 布 DB34/T 3121—2018 前    言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由阜阳市畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：阜阳市立华畜禽有限公司、阜阳市动物疫病预防与控制中心、阜阳市畜牧兽医局、 颍东区畜牧兽医局、阜阳市动物卫生监督所。 本标准主要起草人：孟宪臣、张海涛、郭强、李东风、桑晓媛、高树朋、高永士、潘五岳、郑玉才、 罗燕、刘新、薛亚梅、吴含萍、张娟娟。 I DB34/T 3121—2018 Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术。 本标准适用于对活禽肛拭子和病死禽肝脏进行Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 3 缩略语 以下缩略语适用于本文件。 FadV（Fowl Aviadenovirus）：Ⅰ群禽腺病毒。 FAdV-4（Fowl Adenovirus-4）：Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒。 PCR（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应。 DNA（Deoxyribonucleic Acid）：脱氧核糖核酸。 ExTaq 酶：从水生栖热菌 Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的 DNA 聚合酶，ExTaq 酶是其中的一种。 PBS（Phosphate Buffer Solution）：磷酸盐缓冲液。 SPF（Specific Pathogen Free）：无特定病原。 4 主要仪器 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 高速台式冷冻离心机 生物安全 II 级通风柜 PCR 扩增仪 核酸电泳仪 微量移液器（2 μL、10 μL、100 μL、1000 μL） 超低温冰箱 核酸凝胶成像系统 高压蒸汽灭菌锅 电热恒温鼓风干燥箱 微量振荡器 1 DB34/T 3121—2018 5 主要试剂 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 6 消化液(见第 A.1 章) 2％蛋白酶 K 溶液（见第 A.2 章） 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（见第 A.3 章） 75％乙醇（见第 A.4 章） Gold View 核酸染料 上游引物 P1：FAdV-4（10 μM） 下游引物 P2：FAdV-4（10 μM） 琼脂糖（分析纯） 50×TAE 缓冲液（见第 A.5 章） PBS（见第 A.6 章） DL2000 DNA Marker（见第 A.7 章） 10×Loading Buffer（见第 A.7 章） 双蒸水（符合 GB/T 6682 要求） PCR 用 ExTaq（见第 A.8 章） 10×ExTaq buffer(Mg2+ plus)（见第 A.8 章） dNTP Mixture（见第 A.8 章） 引物 根据 GenBank 登录的 FAdV-4 (GenBank:GU188428.1)Hexon 基因核苷酸序列，设计用于扩增 FAdV-4 的 PCR 引物，FAdV-4 上游引物 P1：FAdV-4（5'-GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC-3'），FAdV-4 下游引物 P2：FAdV-4（5'-TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3'），扩增核酸片段大小为 951 bp。 如果制备的核酸模板中有 FAdV-4，PCR 产物电泳后在 951 bp 处出现条带，即为阳性，反之即为 阴性。 7 样品的采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 7.1.2 7.2 棉拭子和 1.5 mL 离心管，经 121℃高压灭菌 15 min，烘干。 剪刀、镊子和研磨器，经 160℃干热灭菌 2 h。 样品采集 7.2.1 活禽 取泄殖腔拭子，采集方法如下： ——取泄殖腔拭子时，将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便； ——将拭子一并放入盛有 1.0 mL 含双抗 PBS（高压冷却后的 PBS，无菌条件下加入青霉素、链霉 素各 10000 IU/mL）的 1.5 mL 离心管中，加盖标记。 7.2.2 病死禽 病死禽剖检并取肝脏装入一次性塑封袋或其他灭菌容器，标记，送实验室。 2 DB34/T 3121—2018 7.3 样品储运 样品采集后，放入密闭的塑封袋内（一个采样点的样品，放在一个塑封袋内），于保温箱中加冰、 密封，24 小时内进行样品处理。 7.4 样品处理 7.4.1 泄殖腔拭子 样品在震荡器上充分混合后，取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管，编号备用。 7.4.2 组织脏器 取待检样品约 2.0 g 于洁净、干热灭菌的研磨器中充分研磨，加 5 mL PBS 混匀，反复冻融 3 次 后，取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管，编号备用。 7.5 处理后的样品存放 制备的样品在 2℃-8℃条件下保存应不超过 24 h，如需长期保存应置 -70℃以下，并应避免反复 冻融。 8 检测步骤 8.1 实验室规范 Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测的实验室规范应符合 GB 19489 的要求。 8.2 核酸提取 8.2.1 核酸提取参考 GB/T 21674 的要求。 8.2.2 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照和阴性对照数量之和，编号。其中 阳性对照样品为血清学鉴定为 FAdV-4 的病料或阳性病料接种 SPF 鸡胚收获的尿囊液，阴性对照样品为 灭菌双蒸水。 8.2.3 每管加入待检样品（已研磨好的被检样品上清，阳性对照样品和阴性对照样品）100 μL，加入 500 μL 消化液和 10 μL 2％蛋白酶 K 溶液，混匀，置 55℃水浴中 4 h～16 h。 8.2.4 每管加入 600 μL 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，用力颠倒 10 次混匀，13000 g 离心 10 min。 8.2.5 取上清 500 μL 置 1.5 mL 灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置 -70℃冰箱中 30 min， 取出离心管，室温融化，4℃，20000 g 离心 15 min。 8.2.6 弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入 1 mL -20℃预冷的 75％乙醇溶液，轻轻旋转洗一次后 倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上 1 min，置 37℃干燥箱干燥 30 min。 8.2.7 取出离心管，用 50 μL 灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。若需长期保存须放置在 -70℃冰 箱。 8.3 检测 8.3.1 扩增试剂准备 从 ExTaq 试剂盒中取出相应的 10×ExTaq buffer(Mg 取出 FAdV-4 PCR 扩增引物和双蒸水。 2+ plus)、ExTaq 酶和 dNTP Mixture，同时 3 DB34/T 3121—2018 设所需 PCR 的检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照之和，每个样本测试反应 体系配制见表1。 表1 每个样本测试反应体系配置表 试剂 2+ 10×ExTaq buffer(Mg plus) dNTP Mixture 用量 /μL 2 1 P1：FAdV-4（10 μM） 0.5 P2：FAdV-4（10 μM） 0.5 ExTaq 酶 0.3 DNA 模板（质量浓度大于 129.6 pg/μL） 灭菌双蒸水 8.3.2 2 补至 20 加样 在各设定的 PCR 管中分别加入 8.2.6 中制备的 DNA 溶液各 2 μL，瞬时离心数秒。 8.3.3 PCR 反应 将 8.3.2 中离心后的 PCR 管放入 PCR 扩增反应仪内，并对 PCR 管编号，记录对应样本。 反应条件设置： ——第一阶段，94℃预变性 5 min； ——第二阶段，94℃变性 30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸 50 s，30 个循环； ——第三阶段，72℃延伸 10 min。 8.3.4 PCR 产物电泳检测 琼脂糖凝胶的配制： ——按 1％比例称取琼脂糖加入适量 1×TAE 电泳缓冲液中，用微波炉加热完全溶解后，按 1:10000 的比例加入 Gold View 核酸染料，摇匀后倒入试剂中，待冷却使用。 每个样本的 PCR 管取 9 μL 的 PCR 产物，加入 1 μL 的 10×Loading buffer，混匀后，吸取 10 μL 样品加入配制好的琼脂糖凝胶中，同时加入 DL2000 DNA Marker，之后在电压 100 V 下，经 15～ 30 min 电泳，将凝胶放入凝胶成像系统中进行观察，并拍照记录。 9 结果判定 9.1 实验成立条件 9.1.1 9.1.2 9.2 阴性对照样品在 951 bp 位置处无条带。 阳性对照样品在 951 bp 位置处有清晰条带。 结果描述及判定 9.2.1 阴性 样本对应的泳道在 951 bp 位置处无条带，表示样品中无Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸。 4 DB34/T 3121—2018 9.2.2 阳性 样本对应的泳道在 951 bp 位置处出现明显的条带，表示样品中存在Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸 (见附录第A.9 章) 5 DB34/T 3121—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 实验用溶液配制 本标准所用试剂均为分析纯 A.1 消化液 A.1.1 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL）（pH 8.0） 三羟甲基氨基甲烷 灭菌双蒸水 浓盐酸 灭菌双蒸水 A.1.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） 二水乙二铵