ICS 65.120 B 46 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1766—2012 饲料中硝呋烯腙的测定 液相色谱串联质谱法 Determination of nitrovin in feeds by Liquid Chromatography tandem mass spectrometry 2012 – 12 – 24 发布 安徽省质量技术监督局 2013 – 01 – 24 实施 发 布 DB34/T 1766—2012 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。 本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。 本标准主要起草人：顾亮、何俊、徐彦辉、丁磊、董思恩、沈宏林、程坚、杨志才、罗亮、刘坤。 I DB34/T 1766—2012 饲料中硝呋烯腙的测定 液相色谱串联质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中硝呋烯腙残留量测定的液相色谱串联质谱检测方法。 本标准适用于饲料中硝呋烯腙残留量的液相色谱串联质谱法测定和确证。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 用乙腈与DMF的混合溶剂体系提取样品中的硝呋烯腙，经匀浆和离心后，上清液经OPT固相萃取柱净 化，高效液相色谱-串联质谱测定，用阴性样品基质加标工作曲线外标法定量。 4 试剂 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 乙腈（ACN）：色谱纯。 4.3 甲酸：色谱纯。 4.4 二甲基甲酰胺（DMF）：色谱纯。 4.5 提取溶液：ACN＋DMF（60+40）。 4.6 洗脱溶液：DMF＋甲醇（5＋95）。 4.7 甲酸水溶液：0.05％（体积分数）。 4.8 硝呋烯腙标准品。 4.9 标准储备液（1.0 mg/mL）：称取约 0.0100 g 硝呋烯腙标准品，用甲醇溶解并定容至 10.0 mL 棕色容量瓶中 。-18℃避光保存，保存期为三个月。 4.10 标准工作溶液：10 µg/mL。吸取适量硝呋烯腙标准储备溶液（4.9），用甲醇配成标准工作溶液， 组分浓度为 10 µg/mL。4℃避光保存，保存期为三个月，使用前回温到室温。 4.11 OPT 固相萃取柱（50 mg，3 mL）或其它等效柱。 注：除非另有说明，仅使用分析纯试剂。 5 5.1 5.2 仪器和设备 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源。 电子天平：感量 0.0001 g。 1 DB34/T 1766—2012 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 电子天平：感量 0.01 g。 组织匀浆机。 高速台式离心机（最高转速 10000 r/min）。 聚丙烯离心管（50 mL）。 固相萃取装置。 测定步骤 6.1 提取 称取2.0克（精确到 0.01 g）试样于50mL聚丙烯离心管中，加入25.0 mL 提取液（4.5），漩涡混 匀 1 min，超声提取 10 min，10000 r/min 离心 5 min（温度5℃），取上清液。重复提取一次，合并 两次上清液。合并的上清液于 45℃下旋蒸至近干，用 3 mL 水溶液（含2％DMF+1％甲醇）溶解后作为 待净化液（若脂肪过多，可加 3 mL 正已烷除脂，离心后取下层过柱净化）。 6.2 净化 SampliQ OPT固相萃取柱（50 mg，3 mL），使用前分别用 6 mL 甲醇、6 mL 水活化。将待净化液 以不超过 1 mL/min 的速度过柱，弃去滤液。用 3 mL 5％甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干， 再用5mL甲醇溶液（4.6）洗脱并收集洗脱液。洗脱液于 45℃下用氮气吹干，用1mL流动相定容，漩涡混 匀后过 0.22 μm 滤膜，然后进液相色谱-串联质谱测定。 6.3 基质加标标准工作曲线的制备 将标准工作液（4.10）用初始流动相逐级稀释成 2.5 µg/L～100.0 µg/L 的标准系列溶液。称取 与试样基质相应的阴性样品 2.0 g，按照 6.1、6.2 与试样同时进行提取和净化。最后用标准系列溶液 1.0 mL分别定容处理后的空白基质。 6.4 测定 6.4.1 a) b) c) d) e) f) 6.4.2 a) b) c) d) e) f) 2 色谱条件 色谱柱：Zorbax SB C18 柱（30 mm×2.1 mm，1.8 μm）或相当者； 柱温：35℃； 进样量：10 μL； 流速：0.2 mL/min； A：0.05％甲酸水溶液；流动相 B：甲醇； 洗脱方式：等度。 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）； 扫描方式：正离子扫描； 检测方式：多反应监测（MRM）； 雾化气（NEB）、气帘气（CUR）、碰撞气（CAD）均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以 使质谱灵敏度达到检测要求； 喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度； 定性离子对、定量离子对、采集时间（Dwell）见表 2。 DB34/T 1766—2012 表1 中文名称 英文名称 硝呋烯腙 nitrovin 硝呋烯腙监测离子对 定量离子对 定性离子对 定量离子对 361.2 〉222.1 碰撞电压 (eV) 15 110 定性离子对 6.4.3 锥孔电压 (eV) 361.2 〉58.0 25 液相色谱-串联质谱测定 6.4.3.1 定性测定 各检测目标化合物以保留时间和两对离子的（特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰 面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一 致（一致的条件是偏差小于20％），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面 积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致，相对丰度>50％、20％～50％、10％～20％、<10％时，容 许偏差分别为±20％、±25％、±30％和±50％。 6.4.3.2 定量测定 本标准采用外标校准曲线法定量测定。以标准溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，作 校准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。 7 结果计算 测定结果按式（1）计算： X = c×v ........................................ (1) m 式中： X ──样品中目标化合物含量，单位为微克每千克（µg/kg）； C ──测定浓度，单位为微克每升（µg/L）； V ──样品定容体积，单位为毫升（mL）； m ──样品称样量，单位为克（g）。 注：测定结果保留至小数点后一位。 8 方法检测限、准确度和精密度 8.1 方法检测限 本方法在饲料中硝呋烯腙的检测限为 5.0 µg/kg。 8.2 准确度 本方法在 5.0 µg/kg～50.0 µg/kg 添加浓度的回收率均大于 70％。 8.3 精密度 在同一实验室由同一操作者在短暂的时间间隔内用同一设备对同一试样获得的两次独立测定结果 的绝对差值，不得超过算术平均值的 15％。 3 DB34/T 1766—2012 AA 附 录 A （资料性附录） 硝呋烯腙标准物质总离子流图和提取离子流图 _________________________________ 4