ICS 67.040 X 04 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1765—2012 动物油脂中胆固醇含量的测定 液相色谱串联质谱法 Determination of cholesterol in animal and vegetable fats and oils by Liquid Chromatography tandem mass spectrometry 2012 – 12 – 24 发布 安徽省质量技术监督局 2013 – 01 – 24 实施 发 布 DB34/T 1765—2012 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。 本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。 本标准主要起草人：徐彦辉、何俊、顾亮、丁磊、姚艳如、房志杰、刘琴芳、聂磊、程坚、董恩恩。 I DB34/T 1765—2012 动物油脂中胆固醇含量的测定 液相色谱串联质谱法 1 范围 本标准规定了动植物油脂中胆固醇含量的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。 本标准适用于动植物油脂中胆固醇含量的测定。 本标准的方法检出限为 0.25 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义 GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与 再现性的基本方法 3 原理 样品经凝胶渗透色谱净化后，用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行分析，采用标准曲线法定量。 4 试剂 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 乙酸乙酯：色谱纯。 4.3 环己烷：色谱纯。 4.4 异丙醇：色谱纯。 4.5 乙酸乙酯+环己烷（1+1）：取 1000 mL 乙酸乙酯加入到 1000 mL 环己烷中，混合均匀。 4.6 胆固醇的标准物质。 4.7 胆固醇标准贮备液（1.0 mg/mL）：称取 50.0mg 的标准物质，用无水乙醇配置成浓度为（1.0 mg/mL） 标准储备液于 50 mL 容量瓶中，于 4℃的冰箱中避光保存，有效期 6 个月。 4.8 胆固醇的标准工作液：将标准贮备液用无水乙醇稀释至合适浓度，于 4℃的冰箱中避光保存待用， 有效期 4 周。 注：除非另有说明，仅使用分析纯试剂。 5 5.1 仪器与设备 液相色谱-质谱联用仪，配 APCI 离子源。 1 DB34/T 1765—2012 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 6 凝胶渗透色谱分离系统（GPC）或等效分离装置。 分析天平：感量 0.1 mg。 分析天平：感量 0.01 mg。 旋涡混匀器。 氮吹仪。 分析步骤 6.1 试样处理 称取约 0.5 g 样品（精确至 0.01 g），用乙酸乙酯+环己烷（4.5）定容至 10 mL，定容液经凝胶 渗透色谱装置净化（参考条件见附录A），收集流出液，氮吹至近干，并无水乙醇定容至1 mL，供LC-MS/MS 测定。 6.2 平行试验 按试样处理步骤，对同一样品进行平行试验测定。 6.3 空白试验 除不称取试样外，均按试样处理步骤进行。 6.4 标准曲线的绘制 将标准储备液依次稀释至浓度分别为 0.05， 0.1， 0.2，0.4，1.0 mg/L，用LC-MS/MS进行分析测 定，以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。 6.5 测定 6.5.1 a) b) c) d) e) 6.5.2 a) b) c) d) e) f) 2 色谱分析条件 色谱柱：Zorbox SB C18（2.1 mm×50 mm，1.8 µm）或柱效相当的色谱柱； 柱温：35℃； 进样量：10 μL； 流速：0.3 mL/min； 流动相：流动相 A(0.1％甲酸异丙醇溶液)+ 流动相 B（甲醇），20:80，等度洗脱。 质谱分析条件 离子源：大气压化学电离源（APCI）； 扫描方式：正离子扫描； 检测方式：多反应监测（MRM）； 雾化气（NEB）、气帘气（CUR）、碰撞气（CAD）均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以 使质谱灵敏度达到检测要求； 喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度； 定性离子对、定量离子对、碰撞电压和碰撞能量等参数见表 1。 DB34/T 1765—2012 表1 多反应监测模式参数 名称 母离子（m/z） 子离子（m/z） 驻留时间(ms) 碰撞电压（V） 碰撞能量（V） 胆固醇 369.3 147.1(定性) 200 110 25 161.1(定量) 200 110 25 6.5.3 定性测定 在 6.5 仪器条件下，试样溶液和标准品溶液的选择离子色谱峰在相同保留时间处（±0.5％）出现， 并且对应质谱碎片离子的质荷比与标准品一致，其丰度比与标准品相比应符合：相对丰度＞50％，允许 ±10％偏差；相对丰度 20％～50％时，允许±15％偏差；相对丰度 10％～20％时，允许±20％偏差； 相对丰度≤10％，允许±50％偏差，此时可定性确证目标分析物。 6.5.4 定量测定 本标准采用外标校准曲线法定量测定。以标准溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，作 校准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。 6.6 结果计算 胆固醇的含量按下式进行计算： X = C × V3 × V1 ………………………………………（1） m × V2 式中： X——试样中待测物的含量，mg/kg； C——样品溶液中测得的浓度，mg/L； V1——样品定容体积，mL； V2——凝胶净化后吸出的体积，mL； V3——上机测定最终的定容体积，mL； m——试样质量，g。 注：测定结果保留至小数点后两位。 7 检测方法灵敏度、准确度和精密度 7.1 灵敏度 胆固醇在油脂中的检测限为 0.25 mg/kg。 7.2 准确度 本方法在 0.25 mg/kg～2.5 mg/kg 添加范围浓度内，用空白添加标准校正，其回收率范围为 70 ％～120％，相对标准偏差小于 15％。 7.3 精密度 在同一实验室由同一操作者在短暂的时间间隔内用同一设备对同一试样获得的两次独立测定结果 的绝对差值，不得超过算术平均值的 15％。 3 DB34/T 1765—2012 AA 附 录 A （资料性附录） 凝胶渗透色谱分离系统参考条件 A.1 凝胶渗透色谱柱 320 mm×250 mm(内径)，Bio Beads(S-X3)，200～400目，50 g。 A.2 柱分离度 玉米油与邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的分离度>85％。 A.3 流动相 乙酸乙酯：环己烷（1：1）。 A.4 流速 5 ml/min。 A.5 流出收集时间 15 min～30 min。 4 DB34/T 1765—2012 BB 附 录 B （资料性附录） 胆固醇的总离子流图和选择离子流图 图B.1 胆固醇的总离子流图和选择离子流图 _________________________________ 5