ICS 65.020.40 B 61 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2576—2019 柳桉组织培养育苗技术规程 2019 - 04 - 16 发布 四川省市场监督管理局 2019 - 05 - 01 实施 发 布 DB51/T 2576—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 培养基配制 ........................................................................ 1 4 接种 .............................................................................. 2 5 初代培养 .......................................................................... 3 6 启动培养 .......................................................................... 4 7 增殖培养 .......................................................................... 4 8 生根培养 .......................................................................... 5 9 炼苗 .............................................................................. 5 10 洗苗 ............................................................................. 5 11 苗木移栽和管理 ................................................................... 5 12 苗木出圃 ......................................................................... 6 附录 A（资料性附录） 柳桉组织培养培养基配方 .......................................... 7 附录 B（资料性附录） 柳桉苗木质量等级表 .............................................. 8 I DB51/T 2576—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》的规定编写。 本标准由四川省林业和草原局提出并归口。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准起草单位：四川省林业科学研究院。 本标准主要起草人：郭洪英、黄振、李佳蔓、陈炙、辜云杰。 II DB51/T 2576—2019 柳桉组织培养育苗技术规程 1 范围 本标准规定了柳桉(Eucalyptus Saligna)组织培养育苗技术的培养基配置、接种、初代培养、启动 培养、增殖培养、生根培养、炼苗、洗苗、移栽管理和出圃等技术流程。 本标准适用于柳桉在四川省内的组织培养育苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6000 主要造林树种苗木质量分级 LY/T 1770-2008 桉树无性系组培快繁技术规程 LY/T 1882-2010 林木组织培养育苗技术规程 3 培养基配制 3.1 培养基选择 柳桉组织培养在不同阶段使用的培养基见附录A。 3.2 母液配制 3.2.1 水质要求 母液配制应使用蒸馏水、去离子水或超纯水。 3.2.2 大量元素配制 按照LY/T 1770-2008配制。 3.2.3 植物生长调节剂母液的配制 植物生长调节剂母液浓度宜配成0.1 mg/mL～1 mg/mL。 3.2.4 保存 母液容器上应当贴上标签，备注上名称、配制日期、浓度倍数。配制好的母液应置于4℃的冰箱中 冷藏保存。微量元素宜用棕色瓶保存。母液配制后应及时使用，贮藏时间不宜超过3个月。如发现有絮 状物或沉淀产生应停止使用。 3.3 3.3.1 培养基制作 母液吸取 1 DB51/T 2576—2019 按比例吸取母液放入烧杯中，加入蔗糖、卡拉胶和激素后，充分加热溶解并定容。 3.3.2 pH 调节 用1.0 mol／L HCl或1.0 mol／L NaOH调节培养基pH 6.0±0.2。 3.3.3 培养基分装 将未凝固培养基倒入240 mL培养瓶并封口，培养瓶介质为玻璃或塑料。 3.4 培养基灭菌 具体操作参照LY/T 1882-2010。 3.5 培养基储存 灭菌后的培养基应注明编号和配置日期，按用途和时间顺序分别置于培养基储藏室内，储藏室内干 净无风、温度20 ℃，储存时间不应超过30 d。 4 接种 4.1 准备工作 4.1.1 人员准备 接种人员在进入接种室前应在缓冲间穿着专用工作服、拖鞋，佩戴口罩、帽子，接种前用75%乙醇 擦拭双手。 4.1.2 器具准备 接种所用的盘子、镊子、剪刀等器具应先用布袋、报纸包裹，放置在高压灭菌锅内灭菌后再使用， 灭菌条件同3.4。 4.1.3 设备准备 开启工作台紫外灯15 min～20 min，期间禁止人员进入接种室；关闭紫外灯后，开启超净工作台风 机通风15 min后；用75%乙醇擦拭工作台台面和两边挡板。 若使用电热灭菌器应在接种前15 min将其开启。 4.1.4 培养瓶检查 对培养瓶进行检查，剔除污染、瓶裂、盖裂的培养瓶。 4.2 4.2.1 接种 器具消毒 将高温灭菌后的剪刀、镊子等器具用酒精灯或电热灭菌器再次高温处理，处理后应使其足够冷却， 避免烫伤培养材料。 4.2.2 分株 2 DB51/T 2576—2019 在无菌接种盘中，用已冷却的工具将丛芽切分成小芽丛或单个茎段（茎段高度>1 cm）后，将小芽 丛或茎段接种至增殖培养基上，将>1.5 cm的茎段接种到生根培养基上诱导生根。 4.2.3 接种密度要求 初代培养接种1个茎段/瓶，启动培养和增殖培养接种芽丛数8～12丛/瓶或茎段15～20株/瓶，生根 培养接种茎段30株/瓶。芽从或茎段均匀分布，叶片之间无重叠。 4.2.4 操作要求 每接种完一个培养瓶中的材料后，应擦净工具上的培养基，按4.2.1的方法将接种工具重新消毒一 次，同时更换接种盘，避免交叉污染。 4.2.5 标注 接种后，应在培养器皿上标注接种日期、无性系编号、培养基编号、接种人员编号等信息。 4.2.6 接种后处理 熄灭酒精灯或关闭电热灭菌器，用含有75%乙醇的棉球擦拭清洁超级工作台，清洁接种室，最后关 闭超净工作台电源。 5 初代培养 5.1 材料来源 采集外植体的母树应从引种栽培5年及5年以上的柳桉林分中择优选定。 优树具有以下特征：树干通直圆满，主干无明显分叉；冠幅较窄；年均胸径生长量≥4 cm或胸径≥ 候选林分平均胸径15%。 5.2 萌条采集 5.2.1 萌条要求 把优树伐倒或环割优树基部,选择伤口处再生的长50 cm～70 cm、半木质化、无病虫害、健壮萌条。 5.2.2 萌条采集时期 宜在春季或夏季连晴3 d后的上午采集萌条。 5.2.3 萌条处理 用75%乙醇浸泡后的剪刀剪取萌条并修剪叶片，仅萌条顶端保留2片～4片叶。萌条插入深度为5 cm～ 10 cm无菌水的容器内。 采集萌条时，应标记每株优树的萌条，标明编号、采集地点、时间等。 若需运输，宜用保鲜膜完全包裹萌条，4℃～10℃低温保存。保存期不宜超过2 d。 5.3 5.3.1 外植体制备 清洗 3 DB51/T 2576—2019 材料取回后，把萌条剪成长度为5 cm带芽茎段。宜用中性洗洁剂溶液洗净带芽茎段表面，并在流动 净水下冲洗0.5 h～1 h后沥干备用。 5.3.2 消毒 在超净工作台中，用75%乙醇浸泡带芽茎段15 s～20 s，无菌水冲洗3次；用0.1%HgCl2加3滴～5滴表 面活性剂吐温80浸泡带芽茎段5 min～8 min，期间应不断轻摇除掉气泡，无菌水冲洗6次～8次，每次5 min。 宜用无菌吸水纸吸干带芽茎段表面水分，用无菌解剖刀或剪刀切成1 cm～2.5 cm长、带有1个～2个 芽的外植体。 5.4 接种 应使用无菌镊子把外植体垂直或略倾斜接种到MS基本培养基上。 5.5 培养要求 培养室的温度应控制在25℃±2℃。接种后需暗培养5 d，再光照培养5 d～7 d，光照时长12 h/d～14 h/d，光照强度1500 lx～2000 lx。7 d后，淘汰污染的外植体。 6 6.1 启动培养 腋芽诱导 将无菌外植体转入启动培养基中诱导腋芽萌发，启动培养基见附录A，附加0.2 mg/L～0.3 mg/L 6-BA、 0.08 mg/L～0.1 mg/L NAA、0.12 mg/L～0.18 mg/L IBA。 6.2 腋芽诱导培养条件 光照培养室白天温度宜为25℃±2℃，夜晚为20℃±2℃。光照时间12 h/d～14 h/d，光照强度1200 lx～ 3000 lx，清晨9:00前，可在4000 lx～5000 lx以下。增殖培养和生根培养条件相同。 7 7.1 增殖培养 增殖接种 将启动后的外植体剔除老叶和生长活力差的部分，接种到增殖培养基中，接种密度见4.2.3。增殖培 养基见附录A，附加0.3 mg/L～0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L～0.15 mg/L NAA、0.15 mg/L～0.3 mg/L IBA。