ICS 65.020.20 B 16 黑 龙 DB23 江 省 地 方 标 准 DB 23/T 2476—2019 大豆孢囊线虫病抗性室内鉴定方法 2019-11-20 发布 黑龙江省市场监督管理局 2019 - 12 - 19 实施 发 布 DB23/T 2476—2019 前  言 本标准依据 GB/T 1.1—2009 的编写规则起草。 本标准由黑龙江省农业农村厅提出。 本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心、哈尔滨瑞康源生物科技有 限公司、黑龙江省绿色食品科学研究院。 本标准主要起草人：李春杰、王从丽、尤佳、胡岩峰、王英男、潘凤娟、黄铭慧、姜野。 I DB23/T 2476—2019 大豆孢囊线虫病抗性室内鉴定方法 1 范围 本标准规定了大豆孢囊线虫病抗性室内鉴定方法中的试剂、材料和仪器设备、空气环境与培养条件、 鉴定材料、育苗与移苗、培养、线虫接种液制备、接种、调查、抗性评价方法。 本标准适用于对大豆孢囊线虫不同生理小种的抗性鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3095 环境空气质量标准 GB 4404.2 粮食作物种子 第 2 部分：豆类 NY/T 3059 大豆抗孢囊线虫鉴定技术规程 3 3.1 试剂、材料和仪器设备 试剂 霍格兰氏（Hoagland）营养液：硝酸钙 945mg/L、硝酸钾 607mg/L、磷酸铵 115mg/L、硫酸镁 493mg/L、铁盐溶液 2.5mL/L、微量元素 5mL/L、pH6.0，无菌水 1L，使用时稀释 20 倍。 铁 盐 溶 液 ： 七 水 硫 酸 亚 铁 2.78g 、 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 （ EDTA.Na ） 3.73g 、 无 菌 蒸 馏 水 500mL、pH5.5。 微量元素液：碘化钾 0.83mg/L、硼酸 6.2mg/L、硫酸锰 22.3mg/L、硫酸锌 8.6mg/L、钼酸钠 0.25mg/L、 硫酸铜 0.025mg/L、氯化钴 0.025mg/L。 3.2 材料 （a）植物生长袋（长 17.8cm，宽 16.5cm）、（b）快捞夹（长 29.8cm，宽 23.3cm）、（c）快捞 架（长 39.5cm，宽 32.5cm）、（d）蛭石（20 目）、（e）培养钵（高 11.5cm，直径 20cm）。 3.3 仪器设备 （a）孢囊分离筛（20 目、100 目、200 目、500 目）、（b）移液器（5mL）、（c）线虫孵化池、 （d）线虫计数板、（e）光学显微镜（4~40×）、（f）恒温光照培养箱、（g）高压蒸汽灭菌器（121℃、 30min）。 4 4.1 室内空气环境与培养条件 室内空气环境 室内空气环境质量要求符合 GB 3095 的规定。 4.2 培养条件 2 DB23/T 2476—2019 培养箱调至光周期为 16h 光照、8h 黑暗、白天温度 28℃、夜间温度 22℃、相对湿度 70%的循环程 序。 5 鉴定材料 鉴定材料种子质量应符合 GB 4404.2 的规定。 6 育苗与移苗 6.1 育苗 将待鉴定的种子播种在装有无菌蛭石的培养钵中，每钵 40 粒，常规管理。3d 后种子萌发出幼苗， 剔除生长不良的植株，保留生长一致的 30 株幼苗备用。 6.2 移苗 （a）浸湿生长袋。向直立的生长袋内滤纸顶端夹缝内加入无菌水 10mL，使生长袋中的滤纸充分浸 湿且生长袋底部有少量无菌水存留。 （b）移苗。将 30 株备用幼苗转移到浸湿的滤纸顶端夹缝内，保持子叶高于生长袋上沿，每个生长 袋内移入 1 株幼苗。 （c）摆放。每 2 个生长袋放入 1 个快捞夹中，将快捞夹放到快捞架上，每个快捞架上放置 30 个快 捞夹。 7 培养 将整个快捞架置于培养箱中，每三天浇 5mL 霍格兰氏营养液和 5mL 无菌水。 8 线虫接种液制备 8.1 扩繁线虫 经单孢囊纯化的孢囊群体接种在感病品种根部土壤中培养 35d。 8.2 收集孢囊 收集感病品种根部及土壤中的孢囊：将感病品种根和根部土壤放入盛有 1/3 清水的 1L 烧杯中，用 玻璃棒将泥水混合物剧烈搅拌，静置 1min 左右，将上清液依次倒入 20 目和 100 目的孢囊分离筛中。用 高压水枪冲洗 20 目筛子上的感病品种根、土壤及残留物，将落入 100 目筛子上的孢囊冲洗至烧杯中， 用置于漏斗架上的单层滤纸（直径为 12.5cm）过滤。用毛笔轻轻地刷分布于滤纸边缘的孢囊，收集后 即得到大量孢囊。 8.3 分离线虫卵 将收集的孢囊转移到 200 目筛子上，下面套 500 目筛子。用橡皮塞在 200 目筛子上碾磨孢囊使卵释 放出来，高压水枪冲洗，收集落于 500 目筛子上的卵。 8.4 线虫卵孵化 将线虫卵悬液加入线虫孵化池内，置于恒温培养箱（28℃，黑暗）内孵化 4~5d，收集孵化出来的 二龄幼虫悬浮液。 3 DB23/T 2476—2019 8.5 二龄幼虫接种液制备 将二龄幼虫悬浮液注入线虫计数板，于光学显微镜下调查二龄幼虫浓度，不断稀释使线虫浓度调至 170 条/mL，并作为接种液，备用。大豆孢囊线虫不同生理小种二龄幼虫接种液制备方法相同。 9 接种 待测植株侧根生长至 5cm 左右（约 5~7d），从快捞夹中取出生长袋，用移液器向主根和侧根及其 周围均匀滴加 3mL 孢囊线虫二龄幼虫悬浮液，将接种后的生长袋水平放置在培养箱中，24h 后将生长袋 垂直放在快捞架上，置培养箱中继续培养。每个品种接种 30 株，每 10 株为一个重复。 10 调查 培养至 21d 后将生长袋内的滤纸连同整个根系取出，调查每株根系孢囊数量。 11 抗性评价方法 抗性评价方法应按NY/T 3059执行，孢囊指数按照（A.1）计算，对大豆孢囊线虫病抗性评价标准见 表1，鉴定调查表参见附录表A.1。 FI  T  100 ………………………………………………(A.1) C FI-孢囊指数；T-待鉴定材料单株根系平均孢囊数；C-感病对照单株根系平均孢囊数。 表1 对大豆孢囊线虫病抗性评价标准 孢囊指数（IP） 抗性 0~9% 抗（R） 10%~30% 中抗（MR） 31%~60% 中感（MS） >60% 感（S） 4 DB23/T 2476—2019 表A.1 附录 A （规范性附录） 对大豆孢囊线虫病抗性鉴定调查表 日期： 编 号 孢囊数量/株 材料名称 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均 孢囊 指数 (IP) 抗性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 鉴定技术负责人（签字）： 5