(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210112815.3 (22)申请日 2022.01.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114577749 A (43)申请公布日 2022.06.03 (73)专利权人 大连海事大学 地址 116026 辽宁省大连市高新园区凌海 路1号 (72)发明人 田莹　辛芳云　付姚　邢明铭　 庞强　李佳瑶　 (74)专利代理 机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 专利代理师 赵淑梅　李馨 (51)Int.Cl. G01N 21/359(2014.01) G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01)G01N 33/569(2006.01) G01N 33/58(2006.01) (56)对比文件 CN 112444510 A,2021.0 3.05 CN 102908961 A,2013.02.0 6 CN 102539394 A,2012.07.04 CN 103616356 A,2014.0 3.05 CN 110591692 A,2019.12.20 CN 109632755 A,2019.04.16 CN 108827891 A,2018.1 1.16 US 2020408689 A1,2020.12.31 刘晶等.基 于光诱导荧光技术的浮游植物光 合作用活性原位测量方法. 《光谱学与光谱分 析》 .2013,(第09期),24 43-2447. 梁瑜等.应用叶绿素荧 光法测定微藻生物量 的方法. 《生态科 学》 .2009,(第05期),420 -423. 审查员 戴琳 (54)发明名称 一种船舶压载水微藻含量的原位检测方法 (57)摘要 本发明属于船舶压载水微藻含量检测技术 领域， 具体涉及一种船舶压载水微藻含量的原位 检测方法。 所述方法利用荧光探针的发射峰与压 载水微藻叶绿素a的吸收峰高度重叠， 发生竞争 发射， 引起探针荧光强度的改变， 建立微藻密度 与探针发光强度之间的关系模型， 从而快速计算 压载水样 本中微藻的生物量。 本发 明采用近红外 光(NIR)作为激发光源， 光毒性低、 背景荧光低、 检测灵敏度高； 采用的无机上转换纳米粒子， 其 光物理化学性质稳定、 无光闪烁、 无光漂白现象， 并且适用于有腐蚀性的压载水环 境； 表面功能化 修饰赋予探针良好的水溶性以及生物相容性， 可 直接进入微 藻细胞， 实现压载水中微藻细胞数量 的原位快速 检测。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 114577749 B 2022.10.14 CN 114577749 B 1.一种船舶压载 水微藻含量的原位检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1： 将表面功能化的上转换纳米荧光探针分散在 溶剂中， 配制成浓度 为1‑10 mol/L 的探针储备液A； 步骤2： 取含不同微藻生物量的压载水水样， 将探针储备液A分别加入各组 压载水水样中共同孵育， 进行荧光光谱测量， 由于微藻细胞内叶绿素a与探针在红光区产生 竞争发射， 从而建立压载 水水样微藻生物量与探针荧 光强度之间的关系曲线； 步骤3： 取待测压载水水样， 加入探针储备液A， 共同孵育后， 进行荧光光谱测量， 根据步 骤2建立的微藻生物量与探针荧光强度之间的关系曲线， 获得待测压载水水样 中的微藻生 物量； 所述步骤1中表面功能化的上转换纳米荧 光探针的制备 方法包括以下步骤： 步骤A： 使用高温热分解法或高温共沉淀法制备长碳链配体包覆的上转换纳米粒子， 随 后将长碳链配体包覆的上转换纳米粒子分散在有机溶剂中； 所述上转换纳米粒子为NaYF4: 50%Yb,10%Er或Y2O2S:4%Tm,40%Er； 步骤B： 将NOBF4溶于溶剂a， 与长碳链配体包覆的上转换纳米粒子混匀， 产生沉淀， 随后 离心， 得到表面 为BF4‑的裸纳米粒子； 步骤C： 将步骤B得到的裸纳米粒子溶于溶剂b， 加入带端基的高分子聚合物混匀， 随后 加入不良溶剂c使产生沉淀， 离心， 得到功能化的上转换纳米荧光探针； 溶剂a包括乙醇、 二 氯甲烷、 环己烷、 石油醚中的一种； 溶剂b包括二甲基亚砜、 N， N ‑二甲基甲酰胺、 四氢呋喃、 1， 4‑二氧六环中的一种； 溶剂c包括 正己烷、 环己烷、 石油醚、 丙酮中的一种或两种以上； 所述表面功能化的上转换纳米荧光探针以750 ‑850 nm、 940‑1100 nm、 1450‑1600 nm中 的一个或两个以上波长作为近红外光激发源波长， 发射 光为位于640‑670 nm的红色荧 光。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤1中的溶剂包括二甲基亚砜、 乙醇、 N， N ‑二甲基甲酰胺中的一种或两种以上。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 孵 育时间为0.2 ‑2 h。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 将探针储备液A加入压载水水样共 同 孵育， 使上转换纳米荧 光探针的浓度为0.1 ‑1 mol/L。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于： 所述微藻包括小球藻、 扁藻、 叉鞭藻、 新月藻、 三角褐指藻、 角毛藻、 海链藻或杜式盐藻。 6.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤A中， 长碳链配体溶剂为油 胺、 油酸、 十二硫醇中的一种或两种以上； 有机溶剂为环己烷、 甲苯、 苯、 氯仿、 四氯化碳、 己 烷或戊烷中的一种或两种以上； 上转换纳米粒子尺寸 为10‑100 nm。 7.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤B中， 带端基的高分子聚合物 中， 高分子聚合物包括PEG、 PVP、 PAA、 PEI、 磷脂中的一种或两种以上， 端基包括磷酸基团、 羧 基、 氨基中的一种或两种以上； 带端基的高分子聚合物的分子量 为1‑20k。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114577749 B 2一种船舶压载水 微藻含量的原位检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于船舶压载水微藻含量检测技术领域， 具体涉及采用表面功能化的红色 上转换纳米荧 光探针， 通过竞争性 荧光分析法， 实现微藻含量的原位快速检测。 背景技术 [0002]随着社会的快速发展， 经济趋于全球化， 国际经济贸易日益繁荣， 船舶承载着90％ 以上的货运任务。 为了通过调整船舶的吃水和稳定， 减少船体变形和船体阻力并降低船体 的振动， 改善船舶的适航性， 船舶普遍使用水作为压载物。 然而， 船舶压载水 的排放也成为 了海洋生物和病原体传播的主要途径， 日益严重地破坏着海洋生物链， 给全球经济造成了 极大的损失， 已被被国际海事组织(IM O)认定为海洋 所面临的四大威胁之一。 压载水传播的 外来生物中微藻占很大一部分比例， 微藻入侵使世界各地海岸饱受 “赤潮”影响， 造成当地 生物生病或死亡、 破坏当地生态系统及鱼类资源和休闲设施等， 这些微藻在富营养化的水 体中还会大量繁殖， 在世界范围内造成巨大 的经济及环境损失(国际航行船舶压舱水生物 监测调查报告， 航海技术， 2003， 26， 2 ‑4)。 因此， 压载水在排放之前必须对其中的微藻进行 严格的处理， 然后再利用一定的技术手段进行取样分析， 确认处理后的压载水满足排放标 准， 且不得造成船期延误。 然而， 目前仍然缺乏船舶压载水微藻含量的快速、 准确、 灵敏的检 测方法。 [0003]目前压载水中微藻含量的主要检测方法有： 1)显微计数法， 该方法通过将微藻样 品加入血细胞计数器并置于显微镜下， 根据细胞的大小、 形态、 颜色来判断微藻细胞的活 性， 从而计数， 但是该方法需要实验 人员具备专 业的生物学知识、 人工成本高、 误差大、 工作 强度大以及效率低， 难以实现快速检测； 2)流式细胞术法,该方法利用荧光 染料标记微藻细 胞， 将微藻细胞制成悬浮液， 利用流式细胞仪测量微藻细胞的光信号， 从而判断微藻的含 量， 这种方法具有准确、 效率高的优点， 但缺点是需要昂贵的设备和训练有素 的人员、 样品 前处理繁琐， 难以实现压载水船基快速检测； 3)叶绿素检测法， 该方法以叶绿素a的含量作 为测定微藻生物量的有效指标， 主要通过吸收分光光度法和荧光分光光度法测量叶绿素a 的浓度。 其中， 吸收分光光度法是利用藻类叶绿素a在400 ‑460nm以及650 ‑680nm范围内的吸 光度评估细胞密度和微藻生物 量(同步荧光法测定海水中叶绿素a的含量， 分析仪器， 2004， 3， 24‑26)； 荧光分光光度 法则是利用微藻中叶绿素a在420nm蓝光激发下发射680nm红光的 特性， 通过测量微藻在680nm处的荧光强度， 进而标定藻类生物量。 但是所有这些基于叶绿 素含量的现有检测方法均需要首先萃取微藻中的叶绿素， 需要经过滤、 研磨、 冷藏、 离心等 步骤， 步骤繁琐， 耗时长， 需要专业人员操作， 无法实现船基快速检测。 同时， 在叶绿素萃取 过程需要使用丙酮(酸)、 甲醇等有机溶剂， 对环境造成危害。 目前在文献及专利报道中， 尚 缺乏一种简单、 快速、 可靠的检测方法获得压载 水微藻生物量。 发明内容 [0004]针对以上现有技术的不足， 本发明提供一种快速检测压载水微藻含量的原位检测说　明　书 1/6 页 3 CN 114577749 B 3