(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211312512.2 (22)申请日 2022.10.25 (71)申请人 哈尔滨理工大 学 地址 150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学 府路52号哈尔滨理工大 学 (72)发明人 杨志韬　汪世杰　张洪林　王珊　 (51)Int.Cl. G01N 21/552(2014.01) G01N 1/28(2006.01) (54)发明名称 一种溶液中微含量多西环素的检测方法 (57)摘要 本发明涉及分子检测技术领域， 公开了一种 溶液中微含量多西环素的检测方法， 包括如下步 骤： (1)在经过预处理和自组装膜修饰的表面等 离子体共振(SPR)芯片上制备了对多西环素具有 特异性吸附的分子印迹聚合物膜(MIF)； (2)将所 述修饰有MIF的SPR芯片经过洗脱、 浸 泡活化等处 理后， 将待测样品直接注入所述SPR芯片表面， 测 得所述待测样品溶液中的多西环素含量。 该方法 将MIF与SPR技术相结合， 有效提高了检测的灵敏 度和准确性， 特异性和重现性好， 回收率符合要 求， 操作简单、 快速， 具有重要的实际应用价 值。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 115468935 A 2022.12.13 CN 115468935 A 1.一种溶 液中微含量多西环素的检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)在经过预处理和自组装膜修饰的SPR芯片上制备了对多西环素具有特异性吸附的 MIF； (2)将所述修饰有MIF的SPR芯片经过洗脱、 活化等处理后， 将待测样品直接注入所述 SPR芯片表面， 测得 所述待测样品溶 液中的多西环素含量。 2.根据权利要求1所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于， 所述预 处理包括： 将SPR芯片用水冲洗3 ‑5次， 然后乙醇冲洗4 ‑6次， 最后氮气吹干， 自然冷却后备 用。 3.根据权利要求1所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于， 所述自 组装膜修饰的SPR芯片通过以下方法制得： 将预处理后的SPR芯片浸泡在正十二硫醇溶液 中， 使该正十二硫醇溶 液在SPR芯片表面进行自组装。 4.根据权利要求3所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于， 所述正 十二硫醇溶 液的浓度为1 ‑6mmol/L， 溶剂为乙醇； 所述浸泡的时间为24 ‑48h。 5.根据权利要求1所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于,所述洗 脱包括： 将修饰有MIF的SPR芯片用体积比为1:(8 ‑10)的乙酸 ‑水溶液洗涤5 ‑8次， 再用水洗 涤3‑5次， 干燥备用。 6.根据权利要求1所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于,所述活 化为将修饰有MIF且洗脱后的S PR芯片浸泡在水中15 ‑30min。 7.根据权利要求1所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于,所述对 多西环素 具有特异性吸附的MIF通过包括以下步骤的方法制得： (i)于避光环境下将经过预处理和自组装膜修饰的SPR芯片浸入二苯甲酮溶液中2 ‑4小 时， 用氮气吹干， 完成光引发剂的固定； (ii)依次称取多西环素、 衣康酸、 丙烯酰胺加入水中， 超声15 ‑30min并于避光处静置预 聚合1‑3h， 再加入N,N ’－亚甲基双丙烯酰胺超声10 ‑15min， 完成预聚液的配制； (iii)将步骤(i)处理后SPR芯片置于载玻片上， 预处理和自组装膜修饰过的表面朝上， 固定好后扣上流通池， 将上述预聚液通入流通池中， 打开波长为365nm的UV ‑LED点光源稳定 15‑30min后， 在距离流通池玻璃面上方0.5 ‑2cm处照射1 ‑4h， 完成反应； 反应完成后的SPR芯 片表面使用水冲洗3 ‑5次， 再用乙醇冲洗4 ‑6次， 洗去膜表面未反应的溶液， 氮气吹干， 即在 SPR芯片表面 合成出MIF。 8.根据权利要求7所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于， 所述步 骤(i)中二苯甲醇溶 液的浓度为0.02 ‑0.04g/mL， 溶剂为乙醇。 9.根据权利要求7所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于,所述步 骤(ii)中多西环素、 衣康酸、 丙烯酰胺的摩尔比为(0.1 ‑0.5):3:(4 ‑10),所述多西环素与所 述水的质量与体积比为(0.048 ‑0.24):10g/mL， 所述N,N ’－亚甲基双丙烯酰胺的质量为衣 康酸和丙烯酰胺质量和的1 ‑5wt％。 10.根据权利要求7所述的一种溶液中微含量多西环素的检测方法， 其特征在于,所述 步骤(iii)中预聚液的通入体积为20 0‑300uL、 流速为10 ‑15uL/min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115468935 A 2一种溶液中微含量多西环素的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子检测技术领域， 具体涉及基于表面等离子体共振原理和分子印迹 技术相结合的一种针对溶 液中多西环素的检测方法。 背景技术 [0002]多西环素(Doxycycline， DC)作为第二代 四环素类抗生素， 是一种广谱抗生素， 其 对溶血性链球菌等多 杀性巴氏杆菌和沙门氏菌等 都有抑制作用， 对螺旋体、 衣原体、 支原体 等也有一定的抑制作用， 广泛应用于禽畜类的细菌感染防范与治疗。 然而其滥用会导致其 在水体和动物体内残留， 并通过动物类产品如牛奶、 猪肉、 鸡蛋等进入人体， 对人体健康构 成威胁， 引发日光过敏、 溶血性贫血、 红斑狼疮等疾病。 目前， 针对多西环素的检测方法包括 高效液相色谱法、 荧光分析法、 酶联免疫法、 微生物法等。 这些方法大都存在操作复杂、 缺乏 特异选择性、 耗时漫长、 性 价比低等问题。 [0003]多西环素残留分析是对复杂基质中痕量组分的检测， 采用合适的提纯方法是建立 准确、 快速、 高灵敏多西环素残留检测的关键所在。 分子印迹技术(Molecular  imprinting   technique,MIT)是通过模板诱导自组装 过程使材料特定取向， 从而在材料中形成具有 特异 性识别位点实现专一识别的技术。 该技术所合成的分子印迹聚合物膜(Molecular   imprinting  polymer film， MIF)具有预定识别性、 高特异性选择和广泛适用性等优点。 目 前， 分子印迹聚合物已在人工抗体、 色谱分离、 固相萃 取、 传感技术、 酶催化和许多其他领域 有广泛的应用。 将该技术与合适的分析方法相结合应用于检测， 可实现对待测物快速、 准 确、 高灵敏的检测。 [0004]表面等离子体共振(Surface  Plasmon Resonance， SPR)是一种物理光学现象， 通 常发生在金属—电介质界面， 当光从光密介质入射到光疏介质时在一定入射角条件下发生 全内反射产生倏逝波， 该倏逝波的P偏振分量会引发金属表面等离子体波(SPW)。 当SPW与P 偏振光的频率和波数相等且传播方向一致时， 二者就会产生共振， 使得反射光的光强出现 剧烈的下降现象。 SPR曲线的共振吸收峰对介质折射率的改变是十分敏感的。 基于SPR原理 的分析技术具有灵敏度高、 免标记、 实时监测、 分析快速等优良特性， 在医药、 环境监测和食 品安全等领域已有广泛的应用。 [0005]目前， 国内外未见将对多西环 素有特异性吸附的分子印迹膜(MIF)与SPR检测技术 结合来检测水相中多西环素的研究与报道。 发明内容 [0006]针对于现有检测方法的不足， 本发明提供一种溶液中微含量多西环素的检测方 法， 该方法将对多西环素有 特异性吸附的分子印迹膜与SPR检测技术结合， 不仅提高了检测 的灵敏度和准确性， 且检测快速、 操作简单、 选择性高、 重现性和再生性好， 回收率符合要 求， 能在水相中检测痕量的多西环素， 具有重要的实际应用价 值。 [0007]本发明的目的是通过以下技 术方案实现的：说　明　书 1/5 页 3 CN 115468935 A 3