(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211187167.4 (22)申请日 2022.09.28 (71)申请人 中国农业科 学院农业环境与可持续 发展研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 徐春英　李玉中　李巧珍　毛丽丽　 丁军军　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 张璐 (51)Int.Cl. G01N 1/28(2006.01) G01N 33/24(2006.01) G01N 33/18(2006.01) (54)发明名称 一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法 (57)摘要 本发明涉及氮污染溯源技术领域， 尤其涉及 一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法。 所述方法包 括： 在pH<1.5的条件下， 将 待测样品和磺胺 ‑磷酸 溶液反应去除亚硝酸盐得到硝酸盐溶液； 调节pH 为5~9之后针对所述硝酸盐溶液中的氮氧同位素 进行检测； 所述磺胺 ‑磷酸溶液包括： 以体积百分 比计为5~20%的磷酸、 浓度为2~10 g/100mL的磺 胺。 本发明提供的方法需要的试剂少， 且试剂毒 性低， 测试成本低廉， 对 人体危害小； 同时仍具有 较高的稳定性， 检测结果可靠且稳定， 有效提高 了硝酸盐氮氧同位素测定的准确度和精确度。 权利要求书1页 说明书6页 CN 115266280 A 2022.11.01 CN 115266280 A 1.一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法， 其特 征在于， 包括： 在pH<1.5的条件下， 将待测 样品和磺胺 ‑磷酸溶液反应去除亚硝酸盐得到硝酸盐溶液； 调节pH为5~9之后针对所述硝酸盐溶 液中的氮氧同位素进行检测； 所述磺胺 ‑磷酸溶液包括： 以体积百分比计为5~20%的磷酸、 浓度为2~10 g/100mL的磺胺。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述磺胺 ‑磷酸溶液和所述待测样品的体 积比为1： （5~20） ； 和/或， 所述待测样品和磺胺 ‑磷酸溶液反应的时间为5~10分钟。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述针对所述硝 酸盐溶液中的氮氧同位素 进行检测包括： 采用缺乏N2O还原酶的反硝化细 菌将所述硝酸盐溶液中的硝酸盐转化为N2O之后对氮氧 同位素进行检测。 4.根据权利要 求3所述的方法， 其特征在于， 所述缺乏N2O还原酶的反硝化细菌为致金色 假单胞菌。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述针对所述硝 酸盐溶液中的氮氧同位素 进行检测包括： 将所述致金色假单胞菌置于密闭装置的培养基中培养， 去除所述密闭装置和菌液中的 空气， 加入所述硝酸盐溶 液反应2~24小时， 加入碱液终止反应后检测氮氧同位素值。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特 征在于， 还 包括： 在加入所述硝酸盐溶液的同时， 另 外设置多组加入标准样品的平行实验， 根据标准样 品的氮氧同位素值的检测结果建立校正方程； 采用所述校正方程对所述硝酸盐溶液的氮 氧 同位素值的检测结果进行 校正。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述标准样品包括： USGS32、 USGS34或 USGS35中的一种或多种。 8.根据权利要求5 ‑7任一项所述的方法， 其特征在于， 所述碱液包括KOH或NaOH中的一 种或多种。 9.根据权利要求5 ‑7任一项所述的方法， 其特征在于， 所述培养基为去除了NO3‑的TSB培 养基。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115266280 A 2一种检测硝酸盐氮氧同位素的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及氮污染溯源技 术领域， 尤其涉及一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法。 背景技术 [0002]硝态氮是地球大气圈、 生物圈、 土壤圈、 水圈之间氮素循环过程的关键化学形态， 是植物吸收利用的主要氮化合物之一， 也是水体富营养化的主要污染物， 因此水体硝态氮 来源及转化过程的测定， 对生态环境监测和研究具有重要意义。 稳定同位素技术是识别氮 污染来源和研究迁移转化过程的重要手段。 硝酸盐氮、 氧同位素 的测定方法主要有离子交 换法、 蒸馏法、 扩散法、 反硝化细菌法和化学转化法等， 采用质谱仪的固体或气体模式进行 分析。 反硝化细菌法前处理简单、 所需样品量低、 省时省力、 测量精度高、 准确度好、 安全无 毒， 而且可以同时测定氮、 氧同位素， 已成为目前主流的测定方法。 但是反硝化细菌法以及 许多其它分析方法， 都不能区分硝酸盐和亚硝酸盐的氮氧同位素。 亚硝酸盐是氮循环过程 的中间产物， 因此在许多环境中往往硝酸盐和 亚硝酸盐同时存在， 这对于通过目前大多数 的可以利用的方法正确分析硝酸盐的氮氧同位素组成提出了挑战。 另外， 对于采用示踪技 术的硝酸盐的同位素分析， 也必须去除亚硝酸盐干扰， 才能得到准确的氮氧同位素值。 [0003]目前硝酸盐正确的同位素分析去除亚硝酸盐干扰的方法主要有两种， 一种是采用 抗坏血酸去除亚硝酸盐， 另一种 是扣除混合同位素信号中的亚硝酸盐贡献的差减法。 抗坏 血酸法是将1M的无氧抗坏血酸加入到样品中， 达到终浓度为10mM， 抗坏血酸不与硝酸盐反 应， 而仅与亚硝酸盐选择性反应， 使其转换为NO气体并被惰性气体吹扫 出去。 差减法是， 采 用叠氮化钠 还原法先分析得到亚硝酸盐的氮 氧同位素值， 然后从混合同位素信号中减去亚 硝酸盐的贡献， 通过 校正方程得到硝酸盐氮氧同位素值。 [0004]但是， 抗坏血酸法需要严格无氧， 试验操作繁琐、 持续时间长， 且反应要求苛刻： （1） 每天准备1.0M的抗坏血酸溶液， 要检测抗坏血酸是否被硝酸盐或者亚硝酸盐污染， 要吹 扫2个小时以去除其中的溶解 氧和顶空的O2； （2） 样品要吹扫2h， 以除去样品 中的O2； （3） 无氧 抗坏血酸被加入到样品中， 达到终浓度为 10mM， 用酸洗过的气密性注 射器转移 抗坏血酸时， 吹扫的惰性气体始终保持吹入， 防止氧气进入溶液； （4） 抗坏血酸被加入样品后， 根据样品 中亚硝酸盐的初始浓度要吹扫三小时至过夜。 持续吹扫将产生的NO气体被完全 吹扫出去， 阻止NO形成亚硝酸盐和硝酸盐。 [0005]差减法首先需要用叠氮化钠 ‑醋酸缓冲液将亚硝酸盐还原为N2O， 叠氮化钠是一种 剧毒易爆试剂， 具有较高的危险性； 其次是还原过程中易出现氧同位素分馏， 轻的氧同位素 （16O） 倾向于以水损失， 在后续的反应中产生的氮氧化物就富集重氧 （18O） ， 这种现象导致硝 酸盐的氧同位素需要复杂的校正， 影响了氧同位素 结果的准确性和精确性。 发明内容 [0006]为了解决现有技 术存在的问题， 本发明提供一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法。 [0007]第一方面， 本发明提供一种检测硝酸盐氮氧同位素的方法， 包括：说　明　书 1/6 页 3 CN 115266280 A 3