(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211110148.1 (22)申请日 2022.09.13 (71)申请人 浙江大学 地址 310063 浙江省杭州市紫金港校区农 生环C座10 04 (72)发明人 王媛　童浩杰　蒋明星　李飞　 (74)专利代理 机构 苏州锦尚知识产权代理事务 所(普通合伙) 32502 专利代理师 滕锦林　翁亚娜 (51)Int.Cl. G01N 1/28(2006.01) G01N 1/30(2006.01) G01N 1/34(2006.01) G01N 1/36(2006.01) G01N 23/04(2018.01) (54)发明名称 一种扶桑绵粉蚧表皮透射电镜样品制片方 法 (57)摘要 本发明提供了一种扶桑绵粉蚧表皮透射电 镜样品制片方法。 具体地， 本发明提供了一种昆 虫表皮透射电镜样品的制备方法， 所述方法包括 如下步骤： 取样、 漂洗、 脱水、 渗透、 干燥、 切片， 然 后将所述切片后的样品经柠檬酸 铅溶液染色， 从 而得到扶桑绵粉蚧表皮透射电镜样品。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115452512 A 2022.12.09 CN 115452512 A 1.一种昆虫表皮透射电镜样品的制备 方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： 取样： 解剖活虫样品的虫体表皮并清除内容物， 从而获得 虫体表皮样品； 漂洗： 对虫体表皮样品进行一次或多次漂洗； 脱水： 对漂洗后的样品进行脱水处 理， 得到脱水后的虫体表皮样本； 渗透： 用Spur r包埋剂与丙酮混合液处 理所述的样本后， 用包埋剂渗透处 理样品； 干燥： 将处 理完毕后的样品加入纯Spur r包埋剂中整 姿并加热干燥； 切片： 对所述的样品进行切片； 染色： 将所述切片后的样品经柠檬酸铅溶液染色， 从而得到扶桑绵粉蚧表皮透射电镜 样品。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的染色步骤中， 所述的柠檬酸铅溶液的 浓度为0.0 5‑0.2M。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的漂洗步骤包括： 将虫体表皮样品固定 于戊二醛固定液中， 然后用PBS缓冲液漂洗； 然后将 样品浸入锇酸， 在用缓冲液漂洗 。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的脱水处理包括： 在梯度浓度的乙醇溶 液中对样品进行脱水处 理， 再用乙醇和丙酮分别处 理， 得到脱水后的虫体表皮样本 。 5.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述的乙醇浓度梯度依次包括： 25‑35％(v/v)乙醇水 溶液处理10‑20min； 45‑55％(v/v)乙醇水 溶液处理10‑20min； 65‑75％(v/v)乙醇水 溶液处理10‑20min； 75‑85％(v/v)乙醇水 溶液处理10‑20min； 85‑95％(v/v)乙醇水 溶液处理10‑20min； 90‑100％(v/v)乙醇水 溶液处理10‑20min。 6.如权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的渗透处理包括： 用Spurr包埋剂与丙酮 的0.8‑1.2:0.8 ‑1.2(v/v)混合液和2 ‑4:0.8‑1.2(v/v)混合液分别处理S4的样品后， 用 Spurr包埋剂渗透处 理样品。 7.如权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的干燥处理包括： 将样品加入纯Spurr包 埋剂中整 姿， 然后在6 0‑80℃加热至 干燥。 8.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的切片包括： 在切片机上获得厚度为60 ‑ 80nm的切片， 并收集于带碳膜铜载网格上。 9.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的染色方法为： 将切片完全浸于柠檬酸 铅溶液中染色5 ‑20min， 然后用双蒸水清洗切片并晾干 。 10.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述的昆虫为扶桑绵粉蚧。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115452512 A 2一种扶桑绵粉蚧表皮透 射电镜样品制片方 法 技术领域 [0001]本发明涉及农业科学领域， 具体地， 本发明提供了一种扶桑绵粉蚧表皮透射电镜 样品制片方法。 背景技术 [0002]扶桑绵粉蚧Phenacoccus  solenopsis  Tinsley(半翅目粉蚧科)是一种 世界性的 入侵性害 虫。 其对环境非生物胁迫的适应性 强， 可危害100多种 作物与园林植物， 防治困难， 这与其体表有丰富蜡泌物、 寄主范围广、 繁殖能力强等特点有关。 当前， 防治扶桑绵粉蚧的 主要方法为喷施化学农药， 即化学防治， 表皮作为昆虫与外界直接接触的屏障， 会直接影响 到防治效果。 [0003]国内对棉蚧表皮结构研究较少， 对于蚧类昆虫体壁研究较多的集中在白蜡虫 Ericerus pela(半翅目蜡蚧科)中， 由于其雌虫通过表皮增厚来适应环境越冬， 并具有极强 的泌蜡能力而成为研究热点。 针对粉蚧类昆虫， 研究者的视线多聚焦在粉蚧类昆虫 的表皮 蜡泌物上， 常采用扫描电镜的方法观察表皮上腺体结构等。 尚未有运用透射电镜技术研究 扶桑绵粉蚧表皮结构的相关研究。 [0004]昆虫表皮由三个主要的复合层组成， 即外层的外包膜(Envelope)、 中间的上表皮 层(Epicuticle)和内部的原表皮层(Procuticle)。 外包膜由脂类和蛋白质组成， 可通过共 价结合形成 蛋白质‑醌复合物， 其结构 十分稳定。 扶桑绵粉蚧表皮没有明显的角质层增厚的 情况， 再加上其体型较小， 常规的样品制片方法不能清晰地区分外包膜和上表皮层。 [0005]对此， 本发明提出一种经检验能有效分辨扶桑绵粉蚧表皮外包膜结构的透射电镜 样品制片方法， 可运用推广于粉蚧类外表皮结构研究透射电镜样品的制片。 发明内容 [0006]本发明的目的在于根据现有技术进行改进， 提供一种扶桑绵粉蚧表皮透射电镜样 品的制备方法及其应用。 本发明的扶桑绵粉蚧表皮透射电镜样品的制备方法， 能够直接、 客 观、 准确反映和区分扶桑绵粉蚧表皮结构中的外包膜。 [0007]为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为： 提供一种扶桑绵粉蚧表皮透射电镜 样品的制备 方法， 包括如下步骤： [0008]取样： 解剖活虫样品的虫体表皮并清除内容物， 从而获得 虫体表皮样品； [0009]漂洗： 对虫体表皮样品进行一次或多次漂洗； [0010]脱水： 对漂洗后的样品进行脱水处 理， 得到脱水后的虫体表皮样本； [0011]渗透： 用Spur r包埋剂与丙酮混合液处 理所述的样本后， 用包埋剂渗透处 理样品； [0012]干燥： 将处 理完毕后的样品加入纯Spur r包埋剂中整 姿并加热干燥； [0013]切片： 对所述的样品进行切片； [0014]染色： 将所述切片后的样品经柠檬酸铅溶液染色， 从而得到扶桑绵粉蚧表皮透射 电镜样品。说　明　书 1/5 页 3 CN 115452512 A 3