ICS 65.020.30 B 44 中国实验动物学会团体标准 T/CALAS 90—2020 实验动物

小鼠肝炎病毒逆转录 环 介导等温扩增（ 35-".1 ）检测方法 Laboratory animal-Detection of mouse he patitis virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay  --

发布










































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实施

中国实验动物学会 发布
全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 给出的规则起草。 本文件由中国实验动物学会归口。 本文件由全国实验动物标准化技术委员会（ SAC/TC281 ）技术审查。 本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。 本文件起草单位：上海实验动物研究中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本文件主要起草人：周洁、陶凌云、于海波、陈洪岩、李昌文。 全国团体标准信息平台 实验动物 小鼠肝炎病毒逆转录-环介导等温 扩增（RT-LAMP）检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物小鼠肝炎病毒 （ MHV ）RT-LAMP 检测的原理、方法和结果 判定。 本文件适用于实验小鼠肝炎病毒的检测。 2 规范性引用文件 本文件无规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 逆转录 -环介导等温扩增法 reverse transcription loop-med iated isothermal amplification （RT-LAMP ） 逆转录 -环介导等温扩增法是利用 4～6条特异性引物在具有链置换活性的酶溶液（ Bst DNA 聚合酶和 AMV 逆转录酶的混合溶液） 作用下，恒温条件下 1 h内完成核酸扩增反应 的一种特异、高效、可视化的链取代核酸扩增技术。 4 基本原理 DNA 在65℃左右处于动态平衡状态，利用可以产生环状结构的引物和酶溶液（ Bst DNA 聚合酶和 AMV 逆转录酶的混合溶液） 聚合酶链置换合成的活性，在靶序列两端引物 结合处循环不断地产生环状单链结构，达到高效扩增靶基因的目的，最后通过核酸扩增过程中产生焦磷酸镁沉淀与荧光染料结合产生的绿色荧光判定反应结果。 5 主要试剂和器材 5.1 试剂 5.1.1 病毒基因组 RNA 提取试剂盒。 5.1.2 脱氧核糖核酸环介导等温扩增试剂盒。 5.1.3 环介导等温扩增荧光目视检测试剂。 5.2 器材 5.2.1 水浴锅。 全国团体标准信息平台 第三篇 实验动物检测方法系列标准 116 5.2.2 环介导等温扩增反应管。 5.2.3 生物安全柜。 5.2.4 组织匀浆机。 6 检测方法 6.1 空白对照 DEPC 去离子水。 6.2 阴性对照 提取不含小鼠肝炎病毒的样本 RNA 作为阴性对照。 6.3 阳性对照 提取小鼠肝炎病毒的 RNA 作为阳性对照。 6.4 引物 F3：5′- AAGCAGTTCCAACCAGCG-3 ′ B3：5′- TGGGCACTGCTTGTTTGG-3 ′ FIP：5′-GGCCGGCATCTTTACCGAGCAAAACCTGATATGGCCGAAGA -3 ′ BIP：5′-GCAAGTAACGAAGCAAAGTGCC AGTCCTCTTTTGGCGAGGC -3 ′ LF：5′-TTAGCCAAAACAAGAGCAGCA -3 ′ 6.5 样品的制备 活体小鼠安乐死处死后采集肝脏组织 1.0 g 置于 2 mL 离心管中， 加入适量 0.1 mol/L pH 7.2～7.6的磷酸盐缓冲液（ PBS），充分匀浆后 12 000 r/min 离心 5 min ，取上清，用病毒 基因组 RNA 提取试剂盒提取病毒 RNA ，具体步骤参照产品说明书。测定 RNA 浓度进入 下一步骤或 –80℃保存备用。 6.6 核酸扩增 在反应管中配制 25 μL反应体系，见表 1。 表1 小鼠肝炎病毒 RT-LAMP 反应体系 反应组分 反应量 2×反应缓冲液（ RM） 12.5 μL F I P 引物 40 pmol （1 μL） B I P 引物 40 pmol （1 μL） F 3 引物 5 pmol （1 μL） B 3 引物 5 pmol （1 μL） 酶溶液（ EM） 1 μL D E P C 去离子水 1.5 μL 样本 RNA 5 μL 荧光染料 FDR 1 μL 65℃恒温下反应 60 min 。 全国团体标准信息平台 117 实验动物 小鼠肝炎病毒逆转录 -环介导等温扩增 （RT-LAMP） 检测方法 7 结果判定 反应结束后观察反应液颜色，呈现绿色荧光判为阳性，浅橙色透明为阴性。 8 结果解释 环介导等温扩增敏感度极高，可检出几个拷贝的核酸；通过 4条引物同时锁定 6个特 异性位点，可保证检测结果准确；最低检出值的反应液绿色荧光清晰可见。因此，本试验 只判定阴性、阳性，不设疑似阳性或弱阳性。 9 结果报告 根据判定结果，做出检测报告。 全国团体标准信息平台