ICS 71.100.70 C2682 Y42 团 体 标 准 T/SHRH 021-2019 ________________________________________________________________________________________ 化妆品美白功效 测试 体外重组 3D黑色素模型 测试方法 Comestics whitening ef ficacy test- In vitro Reconstructed human skin contaning melanocytes test method 2019-12-30发布 2020-01-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 T/SHRH 全国团体标准信息平台 T/SHRH 021-2019 1 目 次 前言…………………………………………………………………………………………… 2 1．范围………………………………………………………………………………………… 3 2. 规范性引用文件 ………………………………………………………………………… 3 3. 术语和定义 ……………………………………………………………………………… 3 4. 试验原则…………………………………………………………………… …………… . 3 5. 试剂及仪器设备 ………………………………………………………………………… 4 6. 试验步骤 ………………………………………………………………………………… 4 7. 结果计算 ………………………………………………………………………………… 5 8. 质量控制 ………………………………………………………………………………… 6 9. 结果判定 ………………………………………………………………………………… 6 附录A:（资料性附录） ……………………………………………………………………… 7 全国团体标准信息平台 T/SHRH 021-2019 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1 -2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准的某些内容可能涉及专利，本 标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准起草单位：广东博溪生物科技有限公司、上海家化联合股份有限公司、上海上美化妆品有限 公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生 物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海清轩生物科技有限公司、上海天祥质 量技术服务有限公司、 上海日用化学品行业协 会。 本标准主要起草人： 卢永波、李潇、张艳云 、曹平、陈田、 陈静、廖筝筝 、曾四立、吴梅芳、 陈 贞明、谢阿贵 、廖峰 、姜春鹏、赵奕竹 、马骁、王飞飞、高宏旗 、朱翠翠、 李琼、金坚、陈亦华 全国团体标准信息平台 T/SHRH 021-2019 3 化妆品美白功效 测试 体外重组 3D黑色素模型 测试方法 1 范围 本标准规定了一种基于体外重组 3D黑色素模型的化妆品原料及化妆品成品的美白功效测试方法。 本标准可作为化妆品美白功效测试替代方法之一 ，也可结合其他方法对化妆品美白功效进 行评价。 本标准适用于具有生物化学美白作用的化妆品原料及成品的美白功效测试，不适用于物理遮盖类 美白原料或成品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 化妆品安全技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 标准。 3.1体外重组 3D黑色素皮肤模型 in vitro reconstructed human skin conta ining melanocytes 采用人原代表皮角质形成细胞及黑素细胞共培养形成的一 种复层化 、高度分化的三维重建 皮肤模 型。该类模型需对 外界刺激 （UVB、α-MSH、ET-1等）具有黑化响应 ，及对美白剂（曲酸等）具有美 白响应。 3.2 吸光度 optical density, OD 入射光强度与透射光强度比值的常用对数值。表示被检测物吸收的光学密度。特定波长下，同一 种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。 4 试验原则 4.1 方法简要步骤 本标准采用体外重组 3D黑色素模型（ Mela Kutis®）对具有生物化学美白机理的化妆品原料及成品 进行美白功效性测试。化妆品原料采用液下给药方式，在气液面培养的第 6天（ TA6）开始给药，连 续给药 6次，单次孵育时长为 24h。化妆品成品采用表面给药方式，在模型气液面培养第 6天（TA6）， 第8天（ TA8）进行 2次给药，剂量为 10μL/次，单次给药后孵育时长为 48h。待测物给药、孵育全部 结束后，去除待测物残留，对暴露后的体外重组 3D黑色素模型进行表观色度， L*值，黑色素分布及 黑素含量等测试。 4.2 方法测试终点 生物化学美白主要通过抑制黑色素的合成、阻断 黑色素的转运及加快黑色素的代谢等机制达到美 白功效。体外重组 3D黑色素皮肤模型（ MelaKutis®）具有类似天然皮肤的黑化和美白响应能力，在化 全国团体标准信息平台 T/SHRH 021-2019 4 妆品原料或成品暴露后，通过如下四个测试终点评价受试物美白功效。其中，表观色度与 L*值用于测 定待测物的亮白作用；黑素颗粒分布用于测定待测物的黑素转运抑制作用；黑素含量用于测定待测物 的黑素合成抑制作用。 5 试剂及仪器设备 5.1材料及试 剂 5.1.1 体外重组 3D黑色素皮肤模型 （MelaKutis®）。 5.1.2 体外重组 3D黑色素皮肤模型培养液（ M-TA培养液）。 5.1.3 PBS 缓冲液。 5.1.4 曲酸（ Kojic Acid ，KA）。 5.1.5 二甲基亚砜 （Dimethylsulfoxide ，DMSO）。 5.1.6 乙醇。 5.1.7 乙醚。 5.1.8 氢氧化钠（ NaOH）。 5.1.9 丙二醇。 5.1.10 黑素标准品 （CAS号： 29512 -49-0）。 5.1.11 多聚甲醛（ 4%）。 5.1.12 Masson -Fontana黑色素染色试剂盒 。 5.2 仪器设备 5.2.1 UVB 辐照仪：50mJ/cm2。 5.2.2 酶标仪：405nm。 5.2.3 超净工作台 。 5.2.4 CO 2细胞培养箱 ：37℃± 1℃， 5±1%CO 2，95%相对湿度 。 5.2.5 分析天平 (精度 0.1mg)。 5.2.6 移液器： 连续加样器和 相应吸头、 M25活塞排代式移液器 和相应吸头、 2μL~10μL 、10μL~ 100μL 、 20~200μL 、100~1000μL移液器及相应吸头。 5.2.7 通风柜。 5.2.8 电热恒温水浴锅 （80℃）。 5.2.9 单反相机。 5.2.10 色度仪。 5.2.11 正置显微镜。 5.2.12 低温高速离心机。 6 试验步骤 6.1体外重组 3D黑色素皮肤模型的准备 该步骤在超净工作台中进行。每轮测试中，空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和各待测物组 均需要 1块6孔板。标记 6孔板，在每个孔中加入 3.7 mL的M-TA培养液，并放入无菌悬架，将气液 面培养 3天（ TA3）的体外重组 3D黑色素皮肤模型转移至无菌悬架中，置于 CO 2培养箱中培养（ 37 ±1℃、 5±1% CO 2、95%相对湿度）。每组需用 6个模型，其中表观色度、黑素颗粒分布测定需 3个 重复模型； L*值、黑素含量测定需 3个重复模型。 6.2 UVB诱导 全国团体标准信息平台 T/SHRH 021-2019 5 阳性对照组、 阴性对照组、 待测样品组自 TA3开始， 连续进行 7天UVB辐照， 辐照剂量为 50mJ/cm2/ 次。每次辐照结束后，更换培养液，液量为 3.7 mL/孔。空白对照组不进行 UVB辐照，每天仅更换培 养液，液量为 3.7 mL/孔。 6.3 给药 6.3.1化妆品成品 给药方式 在气液面第 6天（ TA6）和气液面第 8天（ TA8）进行表面给药， 给药量为 10μL。阳性对照 选用 曲酸，给药浓度为 0.05%。 6.3.2 化妆