ICS 67.040 X 11 茶叶及茶制品中黄曲霉毒素 B1的测定 Detection of aflatoxin B 1 in tea and tea products 2022-06-06发布 2022-07-06实施 T/CAQI 272—2022 团 体 标 准 中 国 质 量 检 验 协 会 发布 CAQI 全国团体标准信息平台 T/CAQI 272-2022 I 前 言 本文件参照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利， 本文件的发布机构不应承担识别这些专利的 责任。 本文件由云南农业大学提出 ，由中国质量检验协会归口。 本文件主要起草单位 ：云南农业大学、吉林省产品质量监督检验院、云南省茶叶流通协 会、湖南省茶叶 学会、四川省茶叶流通协会、勐腊易武福元昌茶业有限公司、昆明七彩云南 庆沣祥茶 业股份有限公司 、云南新古派茶业有限公司 。 本文件主要起草人： 盛军、方崇业、李桂杰、杜晓翠、刘俊会、 张旭、杨军、李军英、 戴欣、郭霖、 郑宏儒、 郭金萍、 王佳旭、李适、牛之瑞、郭迎迎、 谷乐、张琳琳、刘峻博、 边策、彭磊、王云。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/CAQI 272-2022 1 茶叶及茶制品中黄曲霉毒素 B1的测定 1 范围 本文件提供了茶叶及茶制品中黄曲霉毒素 B1（以下简称 AFT B 1）的测定方法。 本文件第一法为同位素稀释液相色谱 -串联质谱法，第二法为高效液相色谱法，适用于 绿茶、红茶、黄茶、黑茶、白茶、乌龙茶、再加工茶、固态速溶茶、茶多酚 以及茶黄素中 AFT B 1的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅注日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GB 5009.22 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素 B族和 G族的测定 GB/T 6682 分析实验室用水规格 和试验方法 第一法 同位素稀释液相色谱 -串联质谱法 3 原理 试样中的黄曲霉毒素 B1，用 85%乙腈水提取，固相萃取柱 和免疫亲和柱净化，液相色谱 分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。 4试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 试剂 4.1.1 乙腈（ CH 3CN）：色谱纯。 4.1.2 甲酸（ CH 2O2）：色谱纯。 4.1.3 氯化钠（ NaCl）。 4.1.4 磷酸氢二钠（ Na2HPO 4）。 4.1.5 磷酸二氢钾（ KH 2PO 4）。 4.1.6 氯化钾（KCl）。 4.1.7 盐酸（ HCl）。 4.1.8 吐温 -20,（C58H114O26）。 全国团体标准信息平台 T/CAQI 272-2022 2 4.2 试剂配制 4.2.1 85%乙腈水： 85 mL乙腈（ 4.1.1）中加入 15 mL水。 4.2.2 0.1%甲酸水：取 1 mL甲酸（4.1.2），加水定容至 1000 mL。 4.2.3 磷酸盐缓冲溶液（以下简称 PBS）：称取 8.00 g氯化钠（ 4.1.3）、 1.20 g 磷酸氢二 钠（ 4.1.4）、 0.20 g 磷酸二氢钾（ 4.1.5）、 0.20 g 氯化钾（ 4.1.6），用 900 mL水溶解，用 盐酸（ 4.1.7）调节 pH至7.4±0.1，加水稀释至 1000 mL。 4.2.4 吐温 -20的PBS：取 10 mL吐温 -20（4.1.8），用 PBS稀释至 1000 mL。 4.3 标准品 4.3.1 AFT B 1标准品（ C17H12O6，CAS：1162 -65-8）：纯度 ≥98%，或经国家认证并授 予标准物质证书的标准物质。 4.3.2同位素内标13C17-AFT B 1(C17H12O6，CAS：1217449 -45-0)：纯度≥98%，浓度为 0.5 μg/mL 。 注：标准物质可以满足溯源要求的商品化标准溶液。 4.4 标准溶液配制 4.4.1标准储备溶液（ 10 μg/mL ）:准确称取 AFT B 1（4.3.1）1 mg （精确至 0.01 mg）， 置于 100 mL容量瓶，用乙腈（ 4.1.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为 10 μg/mL 的标准储备液。溶液转移至试剂瓶中后，在 -20℃下避光保存，备用。 4.4.2标准中间液（ 100 ng/mL ）：准确移取 AFT B 1标准储备溶液 1.00 mL至100 mL容 量瓶中，乙腈（ 4.1.1）定容。此溶液密封后避光 -20℃下保存，有效期三个月。 4.4.3 同位素内标工作液 （100 ng/mL ） ： 准确移取 0.5 μg/mL13C17-AFT B 1（4.3.2） 2.0 mL， 用乙腈（ 4.1.1）定容至 10 mL。在 -20 ℃下避光保存，备用 ，有效期三个月 。 4.4.4标准工作溶液：准确移取 AFT B 1 （100 ng/mL ）标准溶液 10 μL、50 μL、100 μL、 200 μL、500 μL、800 μL、1000 μL于10 mL容量瓶中，加入 200 μL 100 ng/mL的同位素内 标工作液， 用初始流动相定容至刻度，配制标准曲线溶液浓度点为： 0.1 ng/mL 、0.5 ng/mL、 1.0 ng/mL 、2.0 ng/mL 、5.0 ng/mL、8.0 ng/mL 、10.0 ng/mL 的系列标准溶液。 4.5 材料 4.5.1 免疫亲和柱： AFT B 1柱容量≥200 ng，回收率 ≥85%（对于不同批次的试剂盒在 使用前需进行质量验证 ，验证方法参见 GB 5009.22附录 B）。 4.5.2 固相萃取 柱： 6 mL，≥1000 mg，含有 PSA、C18和MCX等混合填料 适用于茶 叶样品基质黄曲霉毒素专用型的固相萃取柱。 全国团体标准信息平台 T/CAQI 272-2022 3 4.5.3 玻璃纤维滤纸：快速、高载量、液体中颗粒保留 1.6 μm。 4.5.4 微孔滤头：带 0.22 μm 有机相微孔滤膜（所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无 吸附现象，方可使用）。 4.5.5筛网： 0.85 mm 试验筛孔径。 5 仪器设备 5.1 液相色谱 -串联质谱仪： 带电喷雾离子源。 5.2天平：感量分别为 0.01 mg和0.01 g。 5.3涡旋混合器。 5.4高速粉碎机 。 5.5氮吹仪。 5.6高速均质器：转速 6500 r/min ~24000 r/min 。 5.7 离心机：转速≥ 6000 r/min 。 5.8 pH计。 5.9固相萃取装置。 6 试验步骤 警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应具备相对独立的操作台和废弃 物存放装置。在实验过程中 ，操作者在配制 AFT B 1标准溶液时应按照接触剧毒物的要求采 取相应的保护措施。 6.1 试样制备 试样用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于 0.85 mm孔径试验筛。 6.2 试样前处理 6.2.1提取 准确称取 5.0 g（精确到 0.01 g）样品于 50 mL具塞离心管中，加入 100 μL同位素内标 工作液 （ 4.4.3） ， 加入 20 mL 85% 乙腈水， 涡旋混匀， 高速均质器均质 提取 3 min，6000 r/mi n 离心 10 min ，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，滤液待净化 。 6.2.2 净化 6.2.2.1 固相萃取柱净化 固相萃取柱（ 4.5.2）用 5 mL 85%乙腈水溶液 活化，取4 mL滤液通过固相萃取柱中， 收集净化液，再用 5 mL 85% 乙腈水分两次洗脱， 流速控制在 1 mL/min~3 mL/min ，合并净 化液。氮吹浓缩至 4 mL，用吐温 -20的PBS缓冲液定容至 50 mL，混匀，待免疫亲和柱净 全国团体标准信息平台 T/CAQI 272-2022 4 化。 6.2.2.3 免疫亲和柱净化 6.2.2.3.1免疫亲和柱的准备 将低温下保存的免疫亲和柱（ 4.5.1）恢复至 室温。 6.2.2.3. 2试样的净化 待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至 50 mL注射器筒内，调节下滴速度， 控制样液以 1 mL/min~3 mL/min 的速度稳定下滴。待样液滴完后，往注射器筒内加入 10 mL