ICS 67.120.30 B50 T/MMAT 茂 名 市 罗 非 鱼 协 会 团 体 标准 Q/MMAT 003—2020 罗非鱼中致病菌快速检测方法 2020 - 08 - 03发布 2020 - 08 - 10实施 茂名市罗非鱼协会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/MMAT 003 —2020 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准由 茂名市罗非鱼协会 提出并归口。 本标准起草单位： 茂名市罗非鱼协会 、茂名市食品药品检验所 。 本标准主要起 草人：林莉莉、康婷、 王伯顺、张海明、李海丽、李土贵、伍杰森 本标准为首次发布。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/MMAT 003 —2020 1 罗非鱼中致病菌快速检测方法 1 范围 本标准规定了罗非鱼中沙门氏菌、副溶血性弧菌快速检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结 果判定等技术要求。 本标准适用于在生产、销售环节中对罗非鱼产品进行致病菌快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SC/T 3016 -2004 水产品抽样方法 GB 4789.1 食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB 4789.4 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 GB 4789.7 食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 3 设备和材料 3.1 冰箱：2℃～5℃。 3.2 恒温培养箱： 36℃±1℃。 3.3 均质器。 3.4 电子天平：感量 0.1g。 3.5 无菌吸管： 1mL（具0.01mL刻度）、 10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸头。 3.6 无菌锥形瓶：容量为 250mL。 3.7 无菌培养皿：直径为 90mm。 3.8 PCR管。 3.9 BAX®全自动病原菌检 测系统（启动包）。 4 培养基和试剂 4.1 缓冲蛋白胨水（ BPW）:见附录A中A.1。 4.2 亚硒酸盐胱氨酸（ SC）：见附录 A中A.2。 4.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD)琼脂: 见附录A中A.3。 4.4 营养琼脂 : 见附录A中A.4。 4.5 3%氯化钠碱性蛋白胨水：见附录 A中A.5。 4.6 硫代硫酸盐 -柠檬酸盐 -胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录 A中A.6。 4.7 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录 A中A.7。 4.8 BAX®沙门氏菌的 PCR检测试剂盒。 全国团体标准信息平台 T/MMAT 003 —2020 2 4.9 BAX®弧菌(副溶血/霍乱/创伤)的PCR检测试剂盒。 4.10 API 20E生化鉴定试剂盒。 4.11 副溶血性弧菌生 化鉴定试剂盒。 5 检验程序 5.1 沙门氏菌检验程序 见图1。 取样 25g样品+225ml BPW 36℃±1℃ 8h～18h 1ml增菌液+10mL SC 36℃±1℃ 18h～24h 菌落模板 DNA制备 BAX®系统检测 阴性结果 阳性结果 XLD 划线分离 36℃±1℃ 18h～24h 挑取菌落，接种于营养琼脂 生化鉴定 报告 图1 沙门氏菌检验程序 5.2 副溶血性弧菌检验程序 见图2。 全国团体标准信息平台 T/MMAT 003 —2020 3 取样 25g样品+225ml 3% 氯化钠蛋白胨水 36℃±1℃ 8h～18h 菌落模板 DNA制备 BAX®系统检测 阴性结果 阳性结果 TCBS 划线分离 36℃±1℃ 18h～24h 挑取菌落， 接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板 36℃±1℃ 18h～24h 生化鉴定 报告 图2 副溶血性弧菌检验程序 6 操作步骤 6.1 样品采集及运输 样品采集及运输按照 SC/T 3016 -2004的规定执行。 采集罗非鱼的肌肉组织、肠或鳃用于检测，样 品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。 6.2 样品处理 冷冻样品应 45℃以下不超过 15min或在2℃～5℃不超过 18h解冻。 6.3 样品检测 6.3.1 沙门氏菌增菌及 DNA的制备 无菌操作称取 25g样品，置于盛有 225mL BPW 的无菌均质袋中 ,用拍击式均质器拍击 2min，于36℃± 1℃培养8h～18h。 轻轻摇动培养过的样品混合物， 移取 1mL转种于10mL SC内， 于36℃±1℃培养18h～24h。 沙门氏菌 SC细菌模板 DNA的制备按 BAX ®系统筛选沙门氏菌的 PCR分析试剂盒说明书进行。 6.3.2 副溶血性弧菌增菌及 DNA的制备 无菌操作称取 25g样品，置于盛有 225mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的无菌均质袋中 ,用拍击式均质器 全国团体标准信息平台 T/MMAT 003 —2020 4 拍击2min，于36℃±1℃培养8h～18h。副溶血性弧菌增菌肉汤细菌模板 DNA的制备按 BAX ®系统筛选 副溶血性弧菌的 PCR分析试剂盒说明书进行。 6.3.3 BAX®检测 按照BAX®用户指导书来准备试剂、进行检测的和读取结果。必须按照实验室工作指南来装配、操作 设备并记录使用情况。 7 结果说明 7.1 检测结果 BAX®检测结果为阴性的样品可以出具阴性报告。检测结果为阳性的样品需要继续按照传统的方法进 行培养分析及确认。 7.2 结果确证 7.2.1 沙门氏菌确证方法 将检测为阳性的样品 SC增菌液接种划线于 XLD平板上,于36℃±1℃培养18h～24h。 观察平板上生 长的菌落 , 典型的沙门氏菌在 XLD上呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色 中心， 或呈现全部黑色的菌落， 还有些菌株为黄色菌落， 带或不带黑色中心。 挑取 2个或以上可疑菌落， 划线接种营养琼脂平板，于 36℃±1℃培养18h～24h后，进行生化试验（ API 20E）确认。 7.2.2 副溶血性弧菌确证方法 将检测为阳性的样品增菌液接种划线于 TCBS平板上，于 36℃±1℃培养18h～24h。观察平板上生 长的菌落 ,典型的副溶血性弧菌在 TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类 似口香糖的质感。挑取 2个或以上可疑菌落（从培养箱取出 TCBS平板后，应不超过 1h挑取） ，划线接 种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，于 36℃±1℃培养18h～24h后，进行生化鉴定确认。 全国团体标准信息平台 T/MMAT 003 —2020 5 附 录 A （资料性附录） 培养基和试剂 A.1 缓冲蛋白胨水 (BPW) A.1.1 成分 蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钠 (含12个结晶水 )9.0g，磷酸二氢钾 1.5g，蒸馏水1000mL。 A.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中 ，搅混均匀 ，静置约10min，煮沸溶解 ，调节pH至7.2±0.2，121℃高压灭菌 15min。 A.2 亚硒酸盐胱氨酸 (SC)增菌液 A.2.1 成分 蛋白胨5.0g，乳糖4.0g，磷酸氢二钠 10.0g，亚硒酸氢钠 4.0g，L-胱氨酸0.01g，蒸馏水1000mL。 A.2.2 制法 除亚硒酸氢钠和 L-胱氨酸外 ,将各成分加入蒸馏水中 ,煮沸溶解 ,冷至55℃以下,以无菌操作加入亚 硒酸氢钠和 1g/L L-胱氨酸溶液 10mL(称取0.1g L-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液 15mL,使溶解,再加无菌 蒸馏水至 100mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍 )。摇匀,调节pH至7.0±0.2。 A.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD)琼脂 A.3.1 成分 酵母膏3.0g，L-赖氨酸5.0g，木糖3.75g，乳糖7.5g， 蔗糖7.5g，去氧胆酸钠 2.5g，柠檬酸铁铵 0.8g， 硫代硫酸钠 6.8g，氯化钠 5.0g，琼脂15.0g，酚红0.08g，蒸馏水 1000mL。 A.3.2 制法 除酚红和琼脂外 ，将其他成分加入 400mL蒸馏水中 ，煮沸溶解 ，调节pH至7.4±0.2。另将琼脂加入 600mL蒸馏水中 ，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后 ，再加入指示剂 ，待冷至50℃~55℃倾注平皿。 注:本培养基不需要高压灭菌 ,在制备过程中不宜过分加热 ,避免降低其选择性 ,贮于室温暗处 .本培养基宜于当天制 备,第二天使用 . A.4 营养琼脂 全国团体标准信息平台 T/MMAT 003 —2020 6 A.4.1 成分 蛋白胨10.0g，牛肉膏 3.0g，氯化钠