ICS 65.150 B 50 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 1780—2011 水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及 其代谢物残留量的测定 液相色谱法 2011-01-06 发布 山东省质量技术监督局 2011-03-01 实施 发 布 DB37/T 1780—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省海洋与渔业厅提出。 本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心。 本标准主要起草人：宫向红、刘义豪、刘慧慧、徐英江、秦华伟、任传博、邹荣婕、邓旭修。 I DB37/T 1780—2011 水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物残留量的测定 液相色谱法 1 范围 本标准规定了水产苗种中孔雀石绿(MG)、结晶紫(CV)、亚甲基蓝(MB)及其代谢物残留量的液相色谱 测定方法。 本标准适用于水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物隐色孔雀石绿(LMG)、隐色结晶 紫(LCV)、天青A(AZ-A)、天青B(AZ-B)、天青C(AZ-C)残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 《水产苗种违禁药物抽检技术规范》农业部1192号公告-1-2009 3 原理 样品中残留的孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物用乙腈-乙酸铵缓冲液提取，二氯甲烷液液 萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。 4 试剂 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 一级水的标准。 乙腈：色谱纯。 二氯甲烷：色谱纯。 甲醇：色谱纯。 甲酸。 冰乙酸。 二甘醇。 氨水。 乙酸铵。 盐酸羟胺。 对-甲苯磺酸。 20 %盐酸羟胺溶液：称取盐酸羟胺 20 g，溶解于 100 mL 水中。 1.0 mol/L 对-甲苯磺酸溶液：称取对-甲苯磺酸 19.0 g，溶解于 100 mL 水中。 0.125 mol/L 乙酸铵缓冲溶液：称取 9.64 g 乙酸铵溶解于 1 000 mL 水中，冰乙酸调 pH 到 4.5。 定容液：乙腈+乙酸铵缓冲溶液（20+80，v/v）。 1 DB37/T 1780—2011 4.16 标准品：孔雀石绿（malachite green，MG）、结晶紫（crystal violet，CV）、亚甲基蓝（methylene blue，MB）、天青 A（azure A，AZ-A）、天青 B（azure B，AZ-B）、天青 C（azure C，AZ-C）、隐色 孔雀石绿（leucomalachite green，LMG）、隐色结晶紫（leucocrystal violet，LCV），纯度均大于 98 %。 4.17 标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准品，用乙腈 分别配制成 100μg/mL 的标准储备溶液；准确称取适量的亚甲基蓝、天青 A、天青 B、天青 C 标准品， 用甲醇分别配制成 100μg/mL 的标准储备溶液。-18 ℃避光保存，有效期 6 个月。 4.18 混合标准中间液（1.0μg/mL）：分别准确吸取 1.00 mL 亚甲基蓝、天青 A、天青 B、天青 C、孔 雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的标准储备溶液至 100 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度， 配制成 1.0μg/mL 的混合标准中间液。-18 ℃避光保存，有效期 1 个月。 4.19 混合标准工作溶液：根据需要，临用时准确吸取一定量的混合标准中间液，用定容液准确稀释至 适当浓度。 4.20 洗脱液 A：甲醇 50 mL，二氯甲烷 50 mL，氨水 5 mL，或按其比例，混匀。 4.21 洗脱液 B：洗脱液 A 100 mL，加甲酸 1mL，或按其比例，混匀。 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 6.1 仪器与设备 高效液相色谱仪：配紫外检测器。 电子天平：感量 0.000 01 g。 天平：感量 0.01 g。 离心机：4 000 r/min。 旋涡振荡器。 固相萃取装置。 旋转蒸发仪。 固相萃取小柱：DSC-MCAX，300 mg，3 mL；或与之相当者。 氧化铅柱：35 mm×4.6 mm（内径），柱内填料：氧化铅+硅藻土（1+1）。 测定步骤 样品制备 按照《水产苗种违禁药物抽检技术规范》执行。 6.2 提取 称取10 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管内，加入盐酸羟胺溶液（4.11）1.5 mL，对-甲苯磺 酸溶液（4.12）2.5 mL，乙酸铵缓冲溶液（4.13）5 mL，乙腈10 mL，旋涡混匀1 min，超声提取10 min， 4 000 r/min离心10 min，上清液转移至100 mL离心管中，残渣用乙腈10 mL重复提取，合并上清液。 6.3 液液萃取净化 在100 mL离心管中加入水10 mL，二甘醇2 mL，二氯甲烷15 mL，剧烈振荡2 min，4 000 r/min离心 10 min，将下层溶液转移至100 mL梨形瓶中，继续在100 mL离心管中加入乙腈5 mL、二氯甲烷10 mL， 振荡2 min， 4 000 r/min离心 10 min，下层溶液合并至100 mL梨形瓶中，45℃旋转蒸发至近干，加3 mL 乙腈淋洗梨形瓶，45℃旋转蒸发至近干，用2.5 mL乙腈溶解残渣。 2 DB37/T 1780—2011 6.4 固相萃取净化 将DSC-MCAX柱安装在固相萃取装置上，依次用5 mL乙腈、5 mL水活化，转移提取液到柱上，再用乙 腈洗梨形瓶两次，每次2.5 mL，依次过柱，用5 mL水、5 mL乙腈淋洗，吹DSC-MCAX柱近干，加入6 mL 洗脱液A（4.19），弃去第1 mL洗脱液A，收集其余5 mL洗脱液A于10 mL离心管中，吹DSC-MCAX柱近干， 加2 mL洗脱液B（4.20），收集洗脱液B于另一10 mL离心管中，分别于40℃下氮气吹至近干，向两个离 心管中分别加入定容液溶解残留物，并定容至0.5 mL，各移取400 μL溶液合并，过0.45 μm滤膜，供 液相色谱测定。 6.5 测定 6.5.1 色谱条件 6.5.1.1 6.5.1.2 色谱柱：MG-C18 柱，250 mm×4.6 mm（内径），粒度 5 μm，或与之性能相当者。 流动相：乙腈-乙酸铵缓冲溶液，梯度洗脱程序见表 1。 表1 6.5.1.3 6.5.1.4 6.5.1.5 6.5.1.6 6.5.2 梯度洗脱程序 时间/min 乙腈/% 乙酸铵缓冲溶液/% 0 20 80 12 85 15 25 85 15 26 20 80 35 20 80 流速：1.0 mL/min。 柱温：30 ℃。 检测波长：610 nm。 进样量：50 μL。 标准曲线绘制 准确量取混合标准中间液（4.17），用流动相稀释成AZ-A、AZ-C、MB浓度分别为20 μg/L、40 μg/L、 100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、800 μg/L，AZ-B、MG、CV、LMG、LCV浓度分别为10 μg/L、20 μg/L、 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L的标准工作液。分别取50 μL进样，以峰面积为纵坐标， 浓度为横坐标，绘制标准曲线。 6.5.3 色谱分析 在上述色谱条件下，分别取50 μL混合标准工作溶液及样品溶液进样测定，标准工作溶液和样品溶 液中各待测组分的响应值均应在仪器检测线性范围内。标准品保留时间参考值为：AZ-C 6.45 min、AZ-A 7.20 min、AZ-B 7.76 min、MB 8.29 min、MG 11.82 min、CV 13.62 min、LMG 20.72 min、LCV 21.24 min (见附录A)。 7 7.1 结果计算 计算 3 DB37/T 1780—2011 样品中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物的残留量按公式（1）计算，结果保留三位有效数 字。 X = ρ ×V m ...................................... (1) 式中： X——样品中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； ρ——样品溶液中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物的浓度，单位为微克每升（μg/L）； V——样品最终定容体积，单位为毫升（mL）； m——样品的质量，单位为克（g）。 8 8.1 方法灵敏度、准确度和精密度 灵敏度 本方法的定量限：AZ-C、AZ-A、MB分别为5 μg/kg，AZ-B、MG、CV、LMG、LCV分别为2 μg/kg。 8.2 准确度 本方法AZ-C、AZ-A、MB添加浓度为5 µg/kg～80 µg/kg时，回收率为70 %～120 %，AZ-B、MG、CV、 LMG、LCV添加浓度为2 µg/kg～40 µg/kg时，回收率为70 %～120 %。 8.3 精密度 本方法的批内相对标准偏差≤15 %，批间相对标准偏差≤15 %。 4 DB37/T 1780—2011 AA 0.004 0.003 0.002 LCV - 21.405 AZ-C - 6.520 0.005 0.001 0.000 -0.001 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 图A.1 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 分分 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 22.00 23.00 24.00 22.00 23.00 24.00 标准溶液色谱图（AZ-C、AZ-A、MB 分别为 400 µg/L， AZ-B、MG、CV、LMG、LCV 分别为 200µg/L） 0.007 0.006 0.005 AU 0.004 0.003 0.002 0.001 0.000 -0.001 0.00