ICS 65.150 B 50 浙 江 DB3301 省 杭 州 市 地 方 标 准 DB 3301/T 1096—2018 南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测 方法 2018 - 09 - 05 发布 杭州市质量技术监督局 2018 - 10 - 05 实施 发 布 前  言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由杭州市农业局提出并归口。 本标准起草单位：杭州市水产技术推广总站、杭州萧山农技推广中心水产站、杭州大洋庄 园农业发展有限公司。 本标准主要起草人：叶键、施礼科、许婷、王力、徐铃威、陈凡、蒋静、韩钶、王国成。 DB3301/T 1096—2018 南美白对虾肝肠胞虫聚合酶链式反应检测方法 1 范围 本标准规定了南美白对虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）聚合酶链式反应（PCR） 检测的材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定。 本标准适用于南美白对虾肝肠胞虫的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 检测材料 3.1 水 符合GB/T 6682中一级水的要求。 3.2 Taq 酶 -20℃保存，避免反复冻融。 3.3 dNTPs 含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L，-20℃保存。 3.4 引物 有两对引物，浓度均为25 μmol/L，其序列分别为： F1：5’-CAG CAG GCG CGA AAA TTG TCC A-3’ R1：5’-AAG AGA TAT TGT ATT GCG CTT GCT G-3’，扩增778 bp的片段； F2：5’-CAA CGC GGG AAA ACT TAC CA-3’ R2：5’-ACC TGT TAT TGC CTT CTC CCT CC-3’，扩增上述片段中的176 bp片段。 3.5 DNA 分子量标准 推荐使用DNA ladder 100，各片段大小依次为：1500 bp，1000 bp，900 bp，700 bp，600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp。 3.6 无水乙醇 分析纯，使用前-20℃预冷。 1 DB3301/T 1096—2018 3.7 矿物油 无DNA酶和RNA酶。 4 仪器和设备 4.1 PCR 扩增仪 4.2 电泳仪 输出直流电压0 V～600 V。 4.3 水平电泳槽 50 mL～500 mL，带有凝胶船及样孔梳。 4.4 移液器 量程0.5 L～10 L、10 L～100 L、100 L～1000 L移液器各1支及适配吸头，0.5 L～10 L 移液器建议使用带滤芯吸头。 4.5 紫外透射仪或凝胶成像仪 可遮挡可见光干扰，在230 nm～300 nm波长对凝胶发射紫外线，推荐带照相功能。 4.6 恒温培养箱 4.7 冰箱 具冷藏箱，并带-20℃以下冷冻箱体。 4.8 离心机 转速可达15000 r/min以上。 5 操作步骤 5.1 采样 将待检虾置于采样容器内，加10倍体积以上的95%乙醇，没过待检样，常温保存，可保存30d。采 样数量应符合SC/T 7103水生动物产地检疫采样技术规范的要求。 5.2 样品处理 将待检虾置于灭菌滤纸上，滤干乙醇。幼体、仔虾及小于2 cm的幼虾取完整个体。大于2 cm的幼虾、 亚成年虾及成虾取肝胰腺组织。充分研磨混匀后取10 mg～50 mg的样品，置于1.5 mL的离心管中，立即 进行DNA抽提。 5.3 DNA 抽提 加150 L CTAB溶液(见附录A.1)，研磨成糊状后再加CTAB溶液至900 L。混匀后于25℃作用2 h。 加600 L抽提液1(见附录A.2)，充分混合30 s；12000 r/min离心5 min，取上层水相；加700 L抽提 2 DB3301/T 1096—2018 液2(见附录A.3)，充分混合30 s；12000 r/min离心5 min，取上层水相；加入1.5倍体积-20℃预冷的无 水乙醇，混匀后于-20℃放置30 min以上；15000 r/min离心30 min，弃上清，37℃干燥5 min；最后加 20 L双蒸水溶解，作为PCR模板。 可以采用同等抽提效果的商品化DNA抽提试剂盒。 5.4 设立对照 经序列测定确认为阳性和阴性的对虾组织，按5.3提取获得DNA，分别作为阳性对照和阴性对照； 并以双蒸水作为空白对照。 5.5 第一步 PCR 扩增 5.5.1 在 0.2 mLPCR 管中加入 10×PCR 缓冲液(见附录 A.4)5 mL、25 mmol/L 氯化镁 5 mL、dNTP 1 mL、 引物 F1 和 R1 各 1 mL、Taq 酶 5 U、待测样品 DNA 2 mL，最后加双蒸水至 50 mL。使用不具热盖功能的 PCR 仪时，在反应混合物上覆加 25 mL 矿物油。 5.5.2 低速离心后将 PCR 管置于 PCR 仪中，按以下程序进行扩增：94℃变性 3 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 45 s，35 个循环；72℃ 5 min；4℃保温。 5.6 琼脂糖凝胶电泳 用1×TAE电泳缓冲液(见附录A.5)配置1.5%且含0.5 g/mL EB(见附录A.6)的琼脂糖凝胶平板。将 该凝胶平板放入水平电泳槽，加样孔朝负极，加入1×TAE电泳缓冲液至没过胶面1 mm～2 mm。将6 LPCR扩增产物和2 μL样品缓冲液(见附录A.7)混匀后加入加样孔。5 V/cm电泳约30 min，当溴酚蓝迁 移至琼脂糖凝胶的1/2～2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外灯下观察并判断结果。 5.7 第二步 PCR 反应 5.7.1 第一步 PCR 扩增后的产物经电泳未见目的条带，取 2 mL 产物作为模板；见到目的条带的，可不 作第二步 PCR 扩增。 5.7.2 在 0.2 mLPCR 管中加入 10×PCR 缓冲液 5 mL、25 mmol/L 氯化镁 5 mL、dNTP 1 mL、引物 F2 和 R2 各 1 mL、Taq 酶 5 U、模板 2 mL，最后加双蒸水至 50 mL。在反应混合物上覆加 25 mL 矿物油。 5.7.3 低速离心后将 PCR 管置于 PCR 仪中，按以下程序进行扩增：94℃变性 3 min；94℃ 20 s, 68℃ 20 s，72℃ 20 s，35 个循环；72℃ 5 min；4℃保温。 5.7.4 琼脂糖电泳程序同 5.6。 6 测序 取PCR产物进行基因序列测定，将测序结果与GenBank中参考序列（见附录B）进行同源性比对。 7 结果判定 7.1 检测样品第一次 PCR 扩增后在 778bp 处出现条带，阳性对照在 778bp 处出现条带，阴性对照和空 白对照没有该条带；对检测样品 PCR 产物测序，序列与附录 B 中 F1 至 R1 序列相同，判定为虾肝肠胞虫 阳性； 7.2 检测样品第一次 PCR 扩增阴性产物，第二次 PCR 扩增后在 176 bp 处出现条带，阳性对照在 176bp 处出现条带，阴性对照和空白对照没有该条带；对检测样品的第二次 PCR 产物测序，序列与附录 B 中 F2 至 R2 序列相同，判定为虾肝肠胞虫阳性； 3 DB3301/T 1096—2018 7.3 检测样品第一次和第二次 PCR 扩增均未出现特定条带，阳性对照分别在 778bp 和 176bp 处出现条 带，阴性对照和空白对照没有出现相关条带，判定为虾肝肠胞虫阴性。 A A 4 DB3301/T 1096—2018 附 录 A （资料性附录） 试剂配置 A.1 CTAB溶液 用2%CTAB，1.4 mol/L 氯化钠（NaCl），20 mmol/L EDTA，20 mol/L Tris-HCl pH7.5配制。用前 加巯基乙醇到终浓度0.25%。 A.2 抽提液 1 三氯甲烷/异戊醇（按24:1混合，密闭避光保存）。 A.3 抽提液 2 酚/三氯甲烷/异戊醇（按25:24:1混合，密闭避光保存）。 A.4 10×PCR缓冲液 Tris-HCl KCl TritonX-100 A.5 500 mmol/L pH调至8.8 500 mmol/L 1% 50×TAE电泳缓冲液 Tris 242 g EDTA 18.612 g 水 800 mL 冰乙酸 57.1 mL 用NaOH调pH至8.3，加水到1000 mL，室温保存，使用时用水稀释50倍。 A.6 EB 用水配制成10 mg/mL的浓缩液。每10 mL电泳液或琼脂中加1 μL。 A.7 样品缓冲液 每100 mL含溴酚蓝0.25 g，蔗糖40 g。 5 DB3301/T 1096—2018 BA 附 录 B （资料性附录） 虾肝肠胞虫（EHP）套式 PCR 检测产物序列 1 CCTGAGAGAT GGCTCCCACG TCCAAGGATG GCAGCAGGCG CGAAAATTGT CCACTCTTTT F1 61 GAGAGGAGAC AGTTATGAAA CGTGAGTAGA AGGGTCGAGT GTAAAAACCT TGACGTGAAG 121 CAATTGGAGG GCAAGTTTTG GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT TCCAACTCCA AGAGTGTCTA 181 TGGTGGATGC TGCAGTTAAA GGGTCCGTAG TCGTAGATGC AATTAAAAGG TGGTGTTAAA 241 AGCCATTGAG TTTGTTGAGA GTAGCGGAAC GGATAGGGAG CATGGTATAG GTGGGCAAAG 301 AATGAAATCT CAAGACCCCA CCTGGACCAA CGGAGGCGAA AGCGATGCTC TTAGACGTAT 361 CTGGGGATCA AGGACGAAGG CTAGAGTATC GAAAGTGATT AGACACCGCT GTAGTTCTAG 421 CAGTAAACTA TGCCGACAAT GCTGGGTGTT GCGAGAGCGA TGCTTGGTGT GGGAGAAATC 481 TTA